Potentiële interferentie van HEPES bij de detectie van fluorescentie en chemiluminescentie

Fluorescentieanalyse en chemiluminescentiedetectie nemen een belangrijke plaats in in biomedisch onderzoek vanwege hun hoge gevoeligheid en breed dynamisch bereik. Echter,HEPES-buffer, als veelgebruikte buffer, kan onverwachte interferentie introduceren in dergelijke op optische signalen gebaseerde detectiesystemen, waardoor de nauwkeurige interpretatie van gegevens wordt beïnvloed. Een diepgaand begrip van de bronnen en manifestaties van deze interferenties kan onderzoekers helpen gerichte maatregelen te nemen om de betrouwbaarheid van detectieresultaten te garanderen.

Achtergrondsignaal en fotofysische effecten bij fluorescentiedetectie

Fluorescentiemeting is gevoelig voor veranderingen in de samenstelling van de oplossing. HEPES-moleculen zelf hebben geconjugeerde structuren en kunnen endogene fluorescentie produceren onder specifieke bestraling met excitatielicht. Hoewel hun kwantumopbrengst laag is, kan dit achtergrondsignaal aanzienlijke interferentie veroorzaken wanneer de fluorescentie van het detectiedoel zwak is of de concentratie laag is. Vooral in het ultraviolette excitatiegebied overlapt de fluorescentie-emissie van HEPES met de emissiespectra van enkele veelgebruikte fluorescerende kleurstoffen, zoals endogene tryptofaanfluorescentie in bepaalde eiwitten of indoolsondes, wat resulteert in een afname van de signaal-ruisverhouding. Bovendien kan de aanwezigheid van HEPES de brekingsindex en de diëlektrische constante van de oplossing veranderen, waardoor de kwantumopbrengst en de polarisatiegraad van de fluorescerende groep worden beïnvloed. Bij fluorescentiepolarisatie- of anisotropiemetingen kan dit fysieke effect afwijkingen veroorzaken in de berekening van moleculaire rotatiesnelheden en de studie van intermoleculaire interacties verstoren.

HEPES-poeder

Door licht geïnduceerde chemische reacties en vorming van actieve stoffen

Een opmerkelijk kenmerk van HEPES is de chemische instabiliteit ervan onder lichtomstandigheden. Bij blootstelling aan conventionele laboratoriumverlichting of fluorescentiemicroscopie-excitatielichtbronnen kan HEPES fotokatalytische oxidatiereacties ondergaan, waarbij waterstofperoxide en andere reactieve zuurstofsoorten worden gegenereerd. Deze producten hebben een uitdovend of activerend effect op veel fluorescerende sondes. Waterstofperoxide kan bijvoorbeeld bepaalde reducerende sondes (zoals dichloorfluoresceïne) oxideren, wat leidt tot verbeterde fluorescentiesignalen en een verkeerde inschatting van de niveaus van intracellulaire reactieve zuurstofsoorten. Integendeel, bij detectiesystemen die zijn gebaseerd op het uitdoven van fluorescentie, zoals moleculaire bakens of bepaalde metaalionsondes, kunnen reactieve zuurstofsoorten de structuur van de sonde verstoren en signaalverzwakking veroorzaken. De intensiteit van deze interferentie houdt verband met de duur en intensiteit van de blootstelling aan licht, en het is vooral belangrijk om aandacht aan te besteden bij langdurige live-celbeeldvorming of krachtige laserscanning-experimenten.

Signaalmodulatie-interferentie in chemiluminescentiesysteem

Chemiluminescentiedetectie is doorgaans afhankelijk van door enzym gekatalyseerde substraatoxidatie om aangeslagen tussenproducten te produceren, die op hun beurt fotonen vrijgeven. HEPES kan dit proces via verschillende routes verstoren. Aan de ene kant kan HEPES fungeren als een vrije radicalenvanger of donor, waardoor de elektronenoverdrachtsketen wordt beïnvloed tijdens het katalytische proces van mierikswortelperoxidase of alkalische fosfatase, waardoor de luminescentiekinetiekcurve en de plateau-intensiteit veranderen. Aan de andere kant, als het waterstofperoxide dat wordt geproduceerd door de ontleding van HEPES zich tot een aanzienlijk niveau ophoopt, zal het deelnemen aan de oxidatiereactie van het chemiluminescerende substraat, wat resulteert in een toename van de achtergrondluminescentie of een verschuiving in het lineaire bereik van de standaardcurve. Bij chemiluminescentie-immunoassay op basis van luminol of acridine-ester kan deze interferentie ervoor zorgen dat het signaal van monsters met lage concentratie wordt gemaskeerd, of dat het signaal van monsters met hoge concentratie de verwachtingen overtreft, waardoor de kwantitatieve nauwkeurigheid wordt aangetast.

Interferentie-identificatie en experimentele optimalisatiestrategie

Het identificeren of HEPES interfereert met fluorescentie- of chemiluminescentiesystemen kan worden bereikt door middel van verschillende eenvoudige controles. Bereid blanco monsters voor die alleen buffermiddelen bevatten en vergelijk hun achtergrondsignaalverschillen met zuiverwatersystemen om voorlopig de mate van endogene fluorescentie of spontane luminescentie te bepalen. Meet een reeks monsters met fluorescerende doelgroepen onder vaste lichtomstandigheden, observeer de trend van signaalveranderingen in de loop van de tijd en als er atypische verzwakking of versterking optreedt, duidt dit op de aanwezigheid van fotochemische nevenreacties. Voor experimenten waarvan is bevestigd dat ze beïnvloed zijn, kunnen verschillende maatregelen worden genomen: het verkorten van de blootstellingstijd van de monsters aan licht, het voltooien van de voorbewerking en signaalverwerving onder omstandigheden waarbij licht wordt vermeden; Voeg lage concentraties antioxidanten (zoals gereduceerd glutathion of ascorbinezuur) toe aan het buffersysteem om potentiële reactieve zuurstofsoorten te elimineren; Als alternatief kunnen buffermiddelen met betere fotostabiliteit zoals PIPES of EPPS worden gebruikt, maar hun andere effecten op het experimentele systeem moeten worden geverifieerd. Voor gevallen waarin het gebruik van HEPES vereist is en die gevoelig zijn voor detectie, kan buffervervanging worden uitgevoerd vóór het aflezen van het signaal, of kan de tijdsopgeloste fluorescentiemodus worden gebruikt om kortstondige achtergrondfluorescentie te voorkomen.

De interferentie van HEPES op de detectie van fluorescentie en chemiluminescentie is niet onvermijdelijk, maar vereist wel dat onderzoekers de potentiële impact ervan volledig begrijpen. De optische padinstelling, het sondetype en de reactietijd van elk detectiesysteem zijn verschillend. Daarom wordt aanbevolen om interferentie-evaluatie uit te voeren tijdens de experimentele fase en de evaluatieresultaten op te nemen als onderdeel van de methodologische validatie. Door nauwgezet vergelijkend ontwerp en conditieoptimalisatie kan HEPES nog steeds worden toegepast op de meeste optische signaaldetectie, terwijl ervoor wordt gezorgd dat de verkregen gegevens de nodige resolutie en geloofwaardigheid hebben. Het vasthouden van aandacht aan experimentele details is een effectieve manier om de interferentie van buffermiddelen te verminderen.

Productverpakking

Als fabrikant van HEPES-buffers houdt Desheng strikt toezicht op de productkwaliteit en zet een kwaliteitsafdeling op om batches producten te inspecteren. Pas nadat de verpakking en kwaliteit aan de normen voldoen, kunnen ze vanuit de fabriek worden verkocht. Daarom heeft Desheng unanieme lof ontvangen van klanten. Als u relevante bedoelingen heeft, klik dan op de website om te informeren naar details en aankoop!