Потенциальное вмешательство HEPES при обнаружении флуоресценции и химиолюминесценции

Флуоресцентный анализ и хемилюминесцентное детектирование занимают важное место в биомедицинских исследованиях благодаря своей высокой чувствительности и широкому динамическому диапазону. Однако,HEPES-буфер, как обычно используемый буфер, может создавать неожиданные помехи в таких системах обнаружения на основе оптических сигналов, влияя на точную интерпретацию данных. Глубокое понимание источников и проявлений этих помех может помочь экспериментаторам принять целенаправленные меры для обеспечения достоверности результатов обнаружения.

Фоновый сигнал и фотофизические эффекты при обнаружении флуоресценции

Измерение флуоресценции чувствительно к изменениям состава раствора. Молекулы HEPES сами по себе имеют конъюгированную структуру и могут вызывать эндогенную флуоресценцию при специфическом возбуждающем световом облучении. Хотя их квантовый выход низок, этот фоновый сигнал может стать значительной помехой, когда флуоресценция мишени обнаружения слаба или низкая концентрация. Особенно в области ультрафиолетового возбуждения флуоресцентное излучение HEPES перекрывается со спектрами излучения некоторых обычно используемых флуоресцентных красителей, таких как флуоресценция эндогенного триптофана в некоторых белках или индольных зондах, что приводит к снижению отношения сигнал/шум. Кроме того, присутствие HEPES может изменять показатель преломления и диэлектрическую проницаемость раствора, тем самым влияя на квантовый выход и степень поляризации флуоресцентной группы. При измерениях поляризации флуоресценции или анизотропии этот физический эффект может вызывать отклонения в расчете скорости вращения молекул и мешать изучению межмолекулярных взаимодействий.

ХЕПЕС порошок

Светоиндуцированные химические реакции и образование активных веществ

Одной из примечательных характеристик HEPES является его химическая нестабильность в условиях света. При воздействии обычного лабораторного освещения или источников возбуждающего света флуоресцентной микроскопии HEPES может подвергаться реакциям фотокаталитического окисления, образуя перекись водорода и другие активные формы кислорода. Эти продукты оказывают тушащее или активирующее действие на многие флуоресцентные зонды, например, перекись водорода может окислять определенные восстанавливающие зонды (такие как дихлорфлуоресцеин), что приводит к усилению сигналов флуоресценции и неправильной оценке внутриклеточных уровней активных форм кислорода. Напротив, в системах обнаружения, основанных на тушении флуоресценции, таких как молекулярные маяки или зонды с ионами некоторых металлов, активные формы кислорода могут разрушать структуру зонда и вызывать затухание сигнала. Интенсивность этого вмешательства связана с продолжительностью и интенсивностью воздействия света, и на него особенно важно обращать внимание при длительной визуализации живых клеток или экспериментах по сканированию мощным лазером.

Интерференция модуляции сигнала в хемилюминесцентной системе

Обнаружение хемилюминесценции обычно основано на катализируемом ферментами окислении субстрата с образованием возбужденных промежуточных продуктов, которые, в свою очередь, высвобождают фотоны. HEPES может вмешиваться в этот процесс различными путями. С одной стороны, HEPES может действовать как поглотитель или донор свободных радикалов, влияя на цепь переноса электронов во время каталитического процесса пероксидазы хрена или щелочной фосфатазы, изменяя кинетическую кривую люминесценции и интенсивность плато. С другой стороны, если пероксид водорода, образующийся при разложении HEPES, накапливается до значительного уровня, он будет участвовать в реакции окисления хемилюминесцентного субстрата, что приведет к увеличению фоновой люминесценции или сдвигу линейного диапазона стандартной кривой. В хемилюминесцентном иммуноанализе на основе люминола или сложного эфира акридина это вмешательство может привести к маскировке сигнала образцов с низкой концентрацией или к превышению ожиданий сигнала образцов с высокой концентрацией, тем самым влияя на количественную точность.

Идентификация помех и стратегия экспериментальной оптимизации

Определить, влияет ли HEPES на флуоресцентные или хемилюминесцентные системы, можно с помощью нескольких простых мер контроля. Подготовьте холостые образцы, содержащие только буферные агенты, и сравните различия их фоновых сигналов с системами чистой воды, чтобы предварительно определить степень эндогенной флуоресценции или спонтанной люминесценции. Измерьте серию образцов, содержащих целевые флуоресцентные группы, в условиях фиксированного освещения, наблюдайте за тенденцией изменения сигнала с течением времени, и если происходит нетипичное затухание или усиление, это указывает на наличие побочных фотохимических реакций. Для экспериментов, в которых подтверждено влияние, могут быть приняты различные меры: сокращение времени воздействия света на образцы, завершение предварительной обработки и получения сигнала в условиях избегания света; Добавьте низкие концентрации антиоксидантов (таких как восстановленный глутатион или аскорбиновая кислота) в буферную систему, чтобы устранить потенциальные активные формы кислорода; В качестве альтернативы можно использовать буферные агенты с лучшей фотостабильностью, такие как PIPES или EPPS, но их другие эффекты на экспериментальную систему необходимо проверить. В случаях, которые требуют использования HEPES и чувствительны к обнаружению, можно выполнить замену буфера перед считыванием сигнала или можно использовать режим флуоресценции с временным разрешением, чтобы избежать кратковременной фоновой флуоресценции.

Вмешательство HEPES в обнаружение флуоресценции и хемилюминесценции не является неизбежным, но требует от экспериментаторов полного понимания его потенциального воздействия. Настройка оптического пути, тип зонда и время реакции каждой системы обнаружения различны, поэтому рекомендуется проводить оценку помех на этапе постановки эксперимента и включать результаты оценки в рамках методологической проверки. Благодаря тщательному сравнительному проектированию и оптимизации условий HEPES по-прежнему можно применять для обнаружения большинства оптических сигналов, гарантируя при этом необходимое разрешение и достоверность полученных данных. Удержание внимания к деталям эксперимента — эффективный способ уменьшить влияние буферных агентов.

Упаковка продукта

Как производитель буферов HEPES, Desheng строго контролирует качество продукции и создает отдел качества для проверки партий продукции. Только после того, как упаковка и качество будут соответствовать стандартам, их можно будет продавать с завода. Таким образом, Desheng получила единодушную похвалу от клиентов. Если у вас есть какие-либо соответствующие намерения, пожалуйста, нажмите на веб-сайт, чтобы узнать подробности и совершить покупку!