La selección de agentes de amortiguación biológicos afecta directamente a la estabilidad de los experimentos y productos en cultivo celular, crioconservación celular y preparación de reactivos de diagnóstico in vitro (IVD). HEPES y Tris son dos tipos de sistemas tampón de alta frecuencia que no son intercambiables, pero tienen sus propios límites aplicables.Este artículo comienza con la estructura molecular y las propiedades fisicoquímicas, y resume las diferencias y los escenarios típicos entre los dos.
1.Por qué vale la pena reflexionar sobre los agentes amortiguadores
La sensibilidad de las células al pH es a menudo subestimada.4Los agentes amortiguadores tienen la responsabilidad de estabilizar este intervalo.
El bicarbonato tradicional (NaHCO3/CO)₂) sistema tiene un bajo coste y una gran relevancia fisiológica, pero se basa en un₂Una vez que las células salen de la incubadora, a través del intercambio de líquidos, el lavado, la clasificación, el transporte y el tratamiento de precongelación, la liberación de₂Esto es precisamente por lo que los amortiguadores de Good como HEPES y MOPS entran en el sistema de cultivo celular.
2La estructura molecular determina su "personalidad".
El HEPES (4-hidroxietilpiperazina etanesulfónico) es un agente amortiguador zwitteriónico que contiene un anillo de piperazina básica y un grupo ácido de ácido sulfónico.Su carga neta es cercana a la neutralidad en el pH fisiológicoSu pKa es de aproximadamente 7.5 (25°C), con un rango de amortiguación efectivo de 6,8 a 8.2, que cubre con precisión el rango fisiológico del crecimiento celular.
El Tris (trihidroximetilaminometano) es una amina primaria de base débil con una pKa de aproximadamente 8,06 (25°C) y un rango de amortiguación efectivo de 7,0-9.0Tiene una estructura simple y un coste controlable, y es uno de los agentes tampones con una gran dosis en los laboratorios de biología molecular.
Las diferencias estructurales conducen directamente a las siguientes cuatro diferencias prácticas cuantificables.
3Las diferencias en las cuatro dimensiones
3.1 Estabilidad a temperatura: el coeficiente de temperatura pKa de HEPES es de alrededor de -0,014/°C, y Tris es de alrededor de -0.028 a -0.031/°CEn el funcionamiento práctico, el rendimiento es el siguiente: ajustar el tampón Tris a pH 8,0 a 25 °C.°C, y después de enfriar a 4°Cen la cámara fría, el pH medido aumentará significativamente y luego disminuirá nuevamente a 37°CSin embargo, HEPES tiene un pKa de aproximadamente 7,3-7,4 a 37 °C.°CLos experimentos con células que requieren manipulación de la temperatura cruzada son particularmente sensibles a esto.
3.2 Permeabilidad a la membrana y unión de iones metálicos. El HEPES tiene una fuerte polaridad y no es fácilmente capaz de penetrar la membrana celular; La capacidad de unión con iones metálicos bivalentes como Mg 2+y Ca 2+Tris, como una amina primaria, es una sustancia que se encuentra en el interior de la sangre y en el interior de la sangre.puede formar complejos con algunos iones metálicos y también puede reaccionar con aldehídos y algunos agentes de enlace cruzadoSe requiere una verificación adicional cuando se trate de enzimas dependientes de metales o de sistemas de etiquetado específicos.
3.3 Compatibilidad del sistema de ensayo: el HEPES tiene un impacto limitado en las reacciones bioquímicas, con una absorción extremadamente baja de la luz visible y ultravioleta,y una interferencia mínima en los ensayos espectrofotométricos y enzimáticosNo está exento de sus defectos: los radicales libres pueden generarse bajo exposición a la luz, las líneas celulares fotosensibles y las investigaciones relacionadas con la redox requieren operaciones de evitación de la luz,y los costos de las materias primas también son más altos que los de TrisEl Tris puede causar interferencias en algunos métodos de cuantificación de proteínas, y los límites de tolerancia de las diferentes formulaciones del kit de detección varían mucho.Se recomienda verificar el método específico antes de su uso..
3.4 Dependencia del CO₂Ambos pertenecen a sistemas no bicarbonatados y pueden separarse de la incubadora para mantener el pH. Esta es también la razón principal por la que complementan los sistemas de bicarbonato en soluciones de lavado de células.Buffers de clasificación, y soluciones de conservación del transporte.
4La escena determina la selección.
Cultivo celular y procesamiento celular: medio de cultivo libre de suero, solución de crioconservación celular, solución de lavado, búfer de citometría de flujo,así como la operación in vitro de productos de terapia celular como las células madre y CAR-T., la compatibilidad fisiológica del pH y la baja permeabilidad a la membrana de HEPES son más compatibles.
Diagnóstico molecular e investigación de proteínas: búfer de extracción y amplificación de ácidos nucleicos, sistema de búfer de electroforesis (TAE/TBE), SDS-PAGE, purificación de proteínas,El rango de amortiguadores de Tris y las ventajas de coste son más prominentes.
Reactivos IVD: el Tris se utiliza a menudo como principal agente amortiguador en sistemas como la quimioluminiscencia y las diluciones de ensayo de inmunosorbentes ligados a enzimas.Cuando el sistema de reactivo sea sensible a los iones metálicos o requiera una estabilidad del pH más estricta, el HEPES tiene una ventaja.
En realidad, los dos a menudo coexisten en el mismo proceso: HEPES para el procesamiento de células aguas arriba y Tris para la detección aguas abajo.
5Después de la selección: La consistencia de las materias primas es la variable a largo plazo
La fluctuación del rendimiento del reactivo a menudo no proviene de la fórmula, sino de las diferencias en los lotes de materias primas.y los iones metálicos residuales del amortiguador se transmitirán a la estabilidad del producto final..
Hubei Xindesheng Material Technology Co., Ltd. (anteriormente conocida como Wuhan Desheng Biochemical Technology Co., Ltd.)La Comisión Europea (CE) ha establecido desde hace mucho tiempo un grupo de expertos especializados en la investigación y la producción de agentes biológicos de amortiguación y productos químicos finos relacionados.Su sistema de productos cubre más de 50 modelos como Tris, HEPES, MOPS, Bicine, CAPS, etc., y puede proporcionar personalización de suministro e índice desde gramos hasta niveles de toneladas.La sede central de la compañía se encuentra en Guanggu United Science and Technology CityTiene dos bases de investigación y desarrollo y producción en Gedian y Huanggang (70 acres), con una capacidad de producción anual de 5000 toneladas para todas las categorías.Sus productos se utilizan en el diagnóstico in vitro de la DIV, la biomedicina y las industrias químicas diarias.
HEPES y¿ Qué haces?Comprendiendo los cuatro parámetros subyacentes de pKa, coeficiente de temperatura, permeabilidad a la membrana y compatibilidad,y comparándolos con la propia temperatura de procesoEn el caso de las materias primas, independientemente de cuál se elija, la respuesta se obtiene por sí sola.El suministro estable y la calidad constante del lote son los requisitos previos para que la fórmula se reproduzca de manera estable..
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