Studie zur Zytotoxizität und sicheren Konzentrationsbereich von HEPES

In Diskussionen über Zellkultur,HEPESDiese Aussage ist in Richtung richtig, aber sie kann leicht falsch interpretiert werden als "keine Obergrenze" - in der tatsächlichen Arbeit, wenn die drei Dinge Konzentration, Licht,und osmotischer Druck nicht ordnungsgemäß behandelt werden, werden die experimentellen Ergebnisse immer noch abweichen.

1.weit zitierte Sicherheitsintervalle

Die allgemeine Empfehlung von Desheng ist 10-25 mM, die zur Ergänzung der Pufferkapazität verwendet werden kann, wenn sie außerhalb des Inkubators betrieben wird.Die gemeinsamen Formeln für handelsübliche Kulturmedien fallen ebenfalls in diesen Bereich.: beispielsweise enthält DMEM/F-12 häufig 15mM und DMEM häufig 25mM.

Der Grund für die wiederholte Angabe dieses Intervalls ist, daß er zwei Bedingungen gleichzeitig erfüllt: die Pufferkapazität ist ausreichend, um den pH-Schwankungen bei herkömmlichen Betriebsvorgängen standzuhalten,während der zusätzliche eingeführte osmotische Druck immer noch im akzeptablen Bereich der Zelle liegt.

2.Woher kommt die Obergrenze der Konzentration?

Es gibt drei Hauptgründe, warum die Konzentration nicht unendlich erhöht werden kann.

1Das ist der direkteste. Wenn man HEPES in Form von freier Säure, Alkali oder Natriumsalz hinzufügt, erhöht sich der osmotische Druck der Lösung.Der Toleranzbereich der meisten Säugetierzellen liegt zwischen 260 und 350 mOsm/kgJe höher die Konzentration, desto mehr muss aus NaCl oder NaHCO3 abgezogen werden und desto weniger Raum für die Anpassung der Formel.

2HEPES kann unter sichtbarer Lichtbestrahlung reaktive Sauerstoffspezies wie Wasserstoffperoxid erzeugen.vor allem in Gegenwart von Riboflavin im KulturmediumDaher muss das HEPES enthaltende Kulturmedium weg von Licht gelagert und gehandhabt werden.Es wird empfohlen, das MOPS-System zu verwenden oder Methoden wie die Verringerung der Lichtstärke und das Hinzufügen von reaktiven Sauerstoffspezies zu verwenden..

3Technische Daten deuten darauf hin, dass bei einer Konzentration von mehr als 40 mM einige Zelllinien eine gehemmte Proliferation und morphologische Veränderungen aufweisen können.Es sollte klargestellt werden, dass bei der Empfindlichkeit solcher Wirkungen signifikante Unterschiede in der Zelllinie bestehen., und nicht alle Zellen sind gleich, und es gibt auch keine universelle "Toxizitätsschwelle".

3Warum scheint die Schlussfolgerung von 'Toxizität' immer vage?

Bei der Abfrage der einschlägigen Materialien kann festgestellt werden, dass die Schlussfolgerungen über die Zytotoxizität von HEPES häufig inkonsistent sind.sondern ein signifikanter Unterschied in den experimentellen Bedingungen selbst:

Verschiedene Zelltypen: Die Toleranz von Tumorzelllinien gegenüber Primärzellen und Stammzellen kann erheblich variieren

Unterschiedliche Lichtverhältnisse: Belichtungszeit und Lichtstärke beeinflussen unmittelbar die Erzeugung reaktiver Sauerstoffspezies

Verschiedene Bestandteile des Kulturmediums: Der Gehalt an lichtempfindlichen Bestandteilen wie Riboflavin ist eine wichtige Variable

Unterschiedliche Expositionsdauer: Kurzzeitbetrieb von wenigen Stunden im Vergleich zu langfristiger Kultivierung von mehreren Tagen, die Ergebnisse können nicht direkt verglichen werden

Verschiedene Endpunkte werden bestimmt: Proliferationshemmung, morphologische Veränderungen, Apoptose, Stoffwechselaktivität, Messung verschiedener Dinge

Wenn man daher die Schlussfolgerung trifft, daß "eine bestimmte Konzentration für eine bestimmte Zelle giftig ist", sollte man zunächst bestätigen, ob ihre Versuchsbedingungen mit ihrem eigenen System vergleichbar sind.

4.Bestimmung der Arbeitskonzentration für die eigenen Zellen

Anstatt die Zahlen anderer Leute zu verwenden, ist ein zuverlässigerer Ansatz, ein kleines Gradient-Experiment durchzuführen:

Set Gradienten: 0, 10, 15, 20, 25mM (wenn Sie die Obergrenze erforschen möchten, können Sie eine 40mM-Gruppe hinzufügen)

Einheitlicher pH-Wert: Der endgültige pH-Wert aller Gruppen wird so angepasst, dass er konsistent ist (z. B. 7,4), um zu vermeiden, dass pH-Differenzen als Konzentrationswirkungen falsch beurteilt werden.

Gleichzeitige Impfung: Die Zelldichte, die Grundformel des Kulturmediums und die Serumsorte bleiben gleich, wobei 0 mM als Kontrollwert verwendet wird.

Beobachtungszeitraum: Deine tatsächliche Anbauperiode, z. B. 5-7 Tage

Monitoringindikatoren: tägliche mikroskopische Beobachtung der Morphologie und Konvergenz, Endpunkt, der durch Vitalitätsprüfung quantifiziert wird (z. B. CCK-8, MTT oder blau)

Aufzeichnung des osmotischen Drucks: Aufzeichnung des gemessenen osmotischen Drucks jeder Gruppe, um zwischen Konzentrationswirkung und osmotischem Druck zu unterscheiden

Für empfindliche Zellen wie Primärzellen und Stammzellen wird empfohlen, mit der Prüfung bei niedrigeren Konzentrationen zu beginnen und die Lichtverhältnisse gemeinsam zu erfassen.

5Vier Betriebsgewohnheiten zur Risikominderung

Die Konzentration sollte 25mM nicht überschreiten, es sei denn, es gibt klare experimentelle Beweise für höhere Konzentrationen.

Der gesamte Prozess ist vor Licht geschützt, und sowohl die Reservolösung als auch das Kulturmedium werden fern vom Licht gelagert.

Überprüfen Sie erneut den osmotischen Druck und messen Sie es einmal jedes Mal, wenn die Formel angepasst wird

Auswahl von Zellkultur-Rohstoffen mit einer strengeren Kontrolle von Indikatoren wie Endotoxinen und Schwermetallen, was zu weniger Störungen empfindlicher Zellen führt

Die "niedrige Toxizität" von HEPES ist ein relatives Konzept, kein unbegrenzter Pass.und eine Gradientenvalidierung an eigenen Zellen durchführen, können die meisten Fragen zur Toxizität klar beantwortet werden.

Hubei Xindesheng Material Technology Co., Ltd. bietet maßgeschneiderte Liefermethoden von herkömmlichen Modellen bis hin zu Indikatoren im Bereich biologische PuffermittelDie Kunden können Indikatoren wie Reinheit, Rückstand von Metallionen und UV-Absorption auf der Grundlage ihrer eigenen Versuchssysteme vorschlagen.Das Unternehmen hat seinen Hauptsitz in Guanggu United Science and Technology City.Die jährliche Produktionskapazität aller Kategorien beträgt 5000 Tonnen.