細胞培養における緩衝系の選択は、次のように単純化されることがよくあります。ヘペスまたは重炭酸塩の方が良いです。しかし、実際の作業では、この質問は間違った方向を求めていることがわかります。両者の関係は置換ではなく、「開放システム」と「独立システム」の違いです。これを理解することによってのみ、細胞がインキュベーターから出ると pH が簡単に失われる理由を説明できます。
1.重炭酸塩は「オープンバッファーシステム」です
重炭酸系の反応は非常に単純です: CO₂+H₂○⇌HCO∝⁻+H⁺。ヘンダーソン・ハッセルバッハの方程式によれば、次のようになります。
pH=6.1+log([HCO₃⁻]/(0.03×pCO₂))
24 mmol/L HCO の置換∝⁻および 40mmHg pCO₂、結果は pH 7.40 です。アルカリと酸の比率は正確に 20:1 です。
システムの pKa が 37 であることは注目に値します。℃は約 6.1 であり、生理学的 pH 7.4 からは 1.3 単位離れています。従来の緩衝剤の基準によると（有効範囲はpKa程度）±1）、これはもともと「不適切」な範囲でした。
オープンであるため効果的です: CO₂環境と自由に交換でき、その濃度は外部気相によって固定されます。文献にある例は非常に直感的です。同じ酸負荷の下では、閉鎖系の pH は 7.40 から約 6.9 に低下しますが、開放系では CO が存在します。₂逃げることができるのは約7.36までしか下がりません。
2.インキュベーター: CO₂濃度は重炭酸ナトリウムと組み合わせる必要があります
インキュベーター内では、CO が継続的に供給されます。₂重炭酸塩システムを開いた状態に保ちます。しかし、この 2 つの関係は厳密です。重炭酸ナトリウムの濃度が 2.0 ～ 3.7 g/L の場合、対応する CO 量は₂は5〜10％です。
不一致の影響は非常に直接的です: 高炭酸水素ナトリウムと低 CO₂、培地がアルカリ性になり、フェノールレッド指示薬がピンク紫に変わります。逆に酸性だと培地が黄色くなります。
このロジックは、平衡塩溶液の古典的な微分も説明します。アール塩には高濃度の重炭酸ナトリウムが含まれており、CO2 中で使用するように設計されています。₂環境。ハンクス塩は重炭酸ナトリウムの含有量が低く、大気環境で使用されます。いわゆる「インキュベーターの内側と外側」については、長い間、培地の処方の観点から答えられてきました。
3.保育器の外側: HEPES は「ガスに依存しない」緩衝能力を提供します。
HEPES の pKa は約 7.5 (25℃）、生理的 pH に厳密に準拠し、有効緩衝範囲は 6.8 ～ 8.2 で、膜不透過性、生化学反応への影響が限定的、可視および紫外線吸収が極めて低いことが特徴です。
主な違いは、HEPES の緩衝能力が気相 CO に依存しないことです。₂。したがって、培地の交換、洗浄、選別、輸送、顕微鏡観察など、細胞をインキュベーター内で長時間動作させる必要がある場合、HEPES を添加すると、重炭酸塩によって失われた緩衝能力を補うことができます。メーカーの技術データに記載されている一般的な添加量は 10 ～ 25 mM です。
4.併用時の実践4つのポイント
PH 制御の喪失は、必ずしも間違ったバッファーの選択が原因であるとは限りませんが、より一般的には間違った組み合わせ方法が原因です。
HEPES バッファーはインキュベーター内のみで使用しないでください。 CO が明確に示唆されている文献があります。₂インキュベーターは、HEPES のみで緩衝された培地には適していません。 HEPES が 20mM の場合、重炭酸ナトリウムは 10mM を超えないようにすることをお勧めします。
HEPES を使用する場合は、重炭酸ナトリウムを下方制御する必要があります。 5% CO 環境下での DMEM の調製₂例としての条件: HEPES を使用しない場合、重炭酸ナトリウムは約 3.7 g/L ですが、25 mM HEPES を添加した後は、約 2.2 g/L まで下げる必要があります。
HEPES は光を避ける必要があります。 HEPES を含む培地は強い光にさらされると過酸化水素を発生し、光毒性を引き起こす可能性があります。動作中は直射光を避けてください。
浸透圧に注意してください。 HEPES をナトリウム塩の形で添加すると浸透圧が上昇し、ほとんどの哺乳動物細胞は 260 ～ 350 mOsm/kg に耐えることができます。調整後は実際にテストして検討することをお勧めします。
5.IVD の観点: 炭酸塩システムには別のアイデンティティがあります
IVD 試薬では、炭酸水素塩バッファーの役割は細胞培養の役割とはまったく異なります。これは、ELISA コーティングバッファーとして一般的に使用される選択肢です。
WS/T 792-2021、GB/T 43159、SN/T 5479 などの標準文書および仕様文書では、0.05 mol/L、pH 9.6 の炭酸緩衝液の配合は非常に一貫しています。1.59 g の炭酸ナトリウムと 2.93 g の重炭酸ナトリウムで、定容量は 1000 mL です。
ここで強調されるのは生理学的 pH ではなく、疎水性相互作用と静電相互作用を通じてポリスチレン板の表面へのタンパク質の吸着を促進するアルカリ性環境です。興味深いことに、同じ標準セット内の洗浄溶液と酵素標識希釈液は Tris 緩衝液システム (TBST) に戻りました。テストキット内には、それぞれの機能を同時に実行する複数のバッファーシステムが存在することがよくあります。これが、IVD 原料が一般的に複数のカテゴリーの供給能力を必要とする理由でもあります。
6.選択後、原材料の一貫性は同じままです
緩衝系の比率は配合設計に属しますが、製品に関して言えば、最終的なテストは原料バッチの一貫性です。 HEPES を例にとると、純度、不純物スペクトル、水分、残留金属イオンはすべて、培地と試薬の安定性に寄与します。
湖北新徳勝材料技術有限公司（旧名：武漢徳勝生物化学技術有限公司、2005年設立）は長年にわたり、生物学的緩衝剤および関連するファインケミカル。その製品システムは、HEPES、Tris、MOPS、Bicine、CAPS などの 50 を超えるモデルをカバーしており、グラムからトンのレベルで供給とインデックスのカスタマイズを提供できます。同社の本社は、湖北省鄂州市格店開発区の広谷連合科学技術都市にあります。同社は格店と黄崗の2つの研究開発および生産拠点（70エーカー）を有し、全カテゴリーの年間生産能力は5000トンである。その製品は、IVD 体外診断、生物医学、および日常の化学産業で使用されています。
