A escolha do sistema tampão na cultura celular é muitas vezes simplificada como"HEPESNo entanto, no trabalho prático, pode constatar-se que esta questão está a ser colocada na direcção errada - a relação entre os dois não é de substituição,Mas a diferença entre um "sistema aberto" e um "sistemaSó entendendo isso podemos explicar porque o pH é facilmente perdido quando as células saem da incubadora.
1O bicarbonato é um "sistema tampão aberto".
A reação do sistema de bicarbonato é muito simples: CO₂+H₂O- Não.HCO- Não.+H+De acordo com a equação de Henderson Hasselbach:
pH=6,1+log (([HCO3−]/(0,03 × pCO₂))
Substituição de 24 mmol/L de HCO- Não.e 40 mmHg de pCO₂, o resultado é pH 7,40- a relação de álcali a ácido é exatamente 20:1.
É de notar que o pKa do sistema a 37°CSão cerca de 6.1, que está a 1,3 unidades de distância do pH fisiológico 7.4De acordo com o padrão convencional dos agentes tampões (intervalo eficaz de aproximadamente pKa±1), este foi originalmente um intervalo "inapropriado".
É eficaz devido à sua transparência: CO₂O exemplo na literatura é muito intuitivo - sob a mesma carga ácida, a concentração de ácido é fixada pela fase gaseosa externa.O pH do sistema fechado vai cair de 7.40 a cerca de 6.9, enquanto o sistema aberto onde o CO₂Só pode escapar a quedas de cerca de 7.36.
2.Incubador: CO₂A concentração deve ser combinada com bicarbonato de sódio
Na incubadora, o fornecimento contínuo de CO₂Mas a relação de acoplamento entre os dois é rígida: quando a concentração de bicarbonato de sódio é de 2,0 a 3,7 g/l, a quantidade correspondente de CO₂é de 5 a 10%.
As consequências do desajuste são muito directas: bicarbonato de sódio elevado e baixo CO₂, o meio de cultura se alcalinizará e o indicador vermelho do fenólio ficará roxo-púrpura; pelo contrário, se for ácido, o meio de cultura ficará amarelo.
Esta lógica também explica a diferenciação clássica das soluções de sal de equilíbrio - os sais de Earle contêm concentrações mais elevadas de bicarbonato de sódio e são projetados para uso em CO₂ambientes; o sal de Hanks tem um baixo teor de bicarbonato de sódio e é utilizado em ambientes atmosféricos.O chamado "dentro e fora da incubadora" tem sido respondido há muito tempo em termos da fórmula do meio de cultura.
3.Fora da incubadora: o HEPES proporciona uma capacidade de amortecimento "independente do gás"
O HEPES tem um pKa de aproximadamente 7, 5 (25°C), adere de perto ao pH fisiológico, tem um intervalo de amortecimento eficaz de 6,8-8.2, caracterizado por impermeabilidade da membrana, impacto limitado nas reações bioquímicas e absorção extremamente baixa visível e ultravioleta.
A principal diferença é que a capacidade de amortecimento do HEPES não depende do CO na fase gasosa₂Por conseguinte, quando as células precisam operar durante longos períodos de tempo na incubadora - como mudar o meio, lavar, classificar, transportar,e observação microscópica - a adição de HEPES pode compensar a capacidade de amortecimento perdida pelo bicarbonatoA quantidade geral de adição indicada nos dados técnicos do fabricante é de 10-25 mM.
4Quatro pontos práticos para a utilização combinada
A perda de controlo do pH pode não ser necessariamente devida à selecção do tampão errado, mas mais comumente é devida a métodos de combinação incorretos
O amortecedor HEPES não deve ser utilizado apenas na incubadora.₂As incubadoras não são adequadas para meios tamponados exclusivamente com HEPES; quando o HEPES for de 20 mM, recomenda-se que o bicarbonato de sódio não exceda 10 mM.
Se for utilizado HEPES, o bicarbonato de sódio deve ser regulado para baixo.₂Em alguns casos, o bicarbonato de sódio pode ser utilizado para reduzir a concentração de HEPES, por exemplo: sem HEPES, o bicarbonato de sódio é de cerca de 3,7 g/l, e após adição de 25mM HEPES, deve ser reduzido para cerca de 2,2 g/l.
O meio de cultura que contém HEPES pode gerar peróxido de hidrogénio sob exposição a luz intensa, o que pode causar fototoxicidade.Deve evitar-se a luz direta durante o funcionamento.
A adição de HEPES na forma de sal de sódio aumentará a pressão osmótica, e a maioria das células de mamíferos pode tolerar 260-350 mOsm/kg.Recomenda-se realizar ensaios reais e revisões após ajuste da fórmula..
5.IVD perspectiva: os sistemas de carbonato têm outra identidade
No caso dos reagentes IVD, o papel do tampão de bicarbonato de carbonato é completamente diferente do da cultura de células - é uma escolha comumente utilizada para tampão de revestimento do ELISA.
Nos documentos normais e de especificação, tais como WS/T 792-2021, GB/T 43159, SN/T 5479, a fórmula para a solução tampão de carbonato de 0,05 mol/L e pH 9,6 é altamente consistente: 1.59 g de carbonato de sódio e 2.93g de bicarbonato de sódio, com um volume constante de 1000 ml.
A ênfase aqui não está no pH fisiológico,mas no ambiente alcalino que facilita a adsorção de proteínas na superfície das placas de poliestireno através de interações hidrofóbicas e eletrostáticasCuriosamente, a solução de lavagem e a enzima rotuladas como diluentes no mesmo conjunto de padrões retornaram ao sistema tampão Tris (TBST).Muitas vezes, existem vários sistemas de amortecimento que desempenham simultaneamente as suas respectivas funções - esta é também a razão pela qual as matérias-primas IVD normalmente exigem capacidades de abastecimento de várias categorias.
6Após a selecção, a consistência das matérias-primas permanece a mesma
A proporção do sistema de amortecimento pertence ao desenho da fórmula, e quando se trata do produto, o teste final é a consistência do lote de matéria-prima.Espectro de impurezas, humidade e iões metálicos residuais contribuem para a estabilidade do meio de cultura e dos reagentes.
A Hubei Xindesheng Material Technology Co., Ltd. (anteriormente conhecida como Wuhan Desheng Biochemical Technology Co., Ltd., fundada em 2005) tem sido há muito dedicada à pesquisa e produção deAgentes de amortecimento biológicosO seu sistema de produtos abrange mais de 50 modelos, tais como HEPES, Tris, MOPS, Bicine, CAPS, etc., e pode fornecer a personalização do fornecimento e do índice dos níveis de grama a tonelada.A sede da empresa está localizada em Guanggu United Science and Technology City, Zona de Desenvolvimento de Gedian, Ezhou, província de Hubei. Tem duas bases de P&D e produção em Gedian e Huanggang (70 acres), com uma capacidade de produção anual de 5000 toneladas para todas as categorias.Os seus produtos são utilizados em diagnóstico IVD in vitro, biomedicina e indústrias químicas diárias.
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