HEPES es un tampón zwitteriónico ampliamente utilizado para el cultivo celular, que puede mantener un entorno ácido-base estable dentro del rango de pH fisiológico. Preparando alta concentraciónTampón HEPESLas aguas madres son una operación rutinaria en el laboratorio, pero hay detalles a los que prestar atención en cada paso. La calidad del licor madre y la confiabilidad de los experimentos celulares posteriores están directamente relacionados con los estándares operativos, desde el pesaje y la disolución hasta el ajuste del pH, desde el volumen constante hasta la filtración y la esterilización.
1. Pesar y disolver
Para preparar 1 litro de licor madre HEPES 1M es necesario pesar 238,3 gramos de polvo HEPES. Esta dosis se calcula en función del peso molecular de HEPES. Se recomienda utilizar una balanza con suficiente precisión al pesar para evitar errores de pesaje que puedan causar que la concentración final se desvíe del valor objetivo.
Agregue el polvo de HEPES pesado a aproximadamente 800 mililitros de agua destilada. Cabe señalar que los HEPES tienen poca solubilidad en condiciones ácidas y es posible que no se disuelvan rápidamente cuando se agregan por primera vez al agua. Coloque el recipiente en un agitador magnético y revuelva continuamente hasta que la solución se vuelva completamente clara y transparente, sin partículas no disueltas visibles a simple vista. Este proceso lleva algún tiempo y no debe apresurarse. Si la disolución es lenta, el tiempo de agitación se puede ampliar adecuadamente, pero no es necesario calentarlo porque los HEPES se pueden disolver completamente a temperatura ambiente normal.
2. Ajuste del PH
El polvo de HEPES en sí es débilmente ácido y el pH de la solución después de la disolución es mucho más bajo que el rango objetivo. Se requiere una solución de hidróxido de sodio para ajustar la titulación. Por lo general, se añade lentamente una solución de hidróxido de sodio 1 M a la solución de HEPES en agitación.
El ajuste del PH es el paso más paciente en este proceso de preparación. La solución de hidróxido de sodio se debe agregar en lotes, agitar bien después de cada adición y esperar a que la lectura del medidor de pH se estabilice antes de medir. Cuando se acerque al pH objetivo, es aún más necesario añadir gota a gota para evitar el exceso. Para fines de cultivo celular, el pH objetivo suele establecerse entre 7,3 y 7,4. Se recomienda controlar el pH final en torno a 7,35, ya que puede haber una ligera variación del pH durante los procesos posteriores de filtración y almacenamiento.
La temperatura tiene un impacto en la medición del pH. El valor de pH del tampón HEPES cambia con la temperatura y, si la temperatura de la solución es significativamente mayor o menor que la temperatura ambiente, la lectura medida puede desviarse del pH real a la temperatura de funcionamiento objetivo. Por lo tanto, antes de ajustar el pH, la solución debe enfriarse o calentarse a temperatura ambiente.
3. Volumen constante y filtración.
Después del ajuste del pH, transferir la solución a un matraz volumétrico de 1 litro y diluir hasta la marca con agua destilada. Si el proceso anterior de disolución y ajuste de pH se realizó en un vaso de precipitado, es necesario enjuagar la pared interna del vaso con una pequeña cantidad de agua destilada varias veces para asegurar que todos los componentes HEPES se transfieran al matraz aforado. Después de configurar el volumen, se puede confirmar nuevamente el valor del pH y se pueden realizar ajustes menores si es necesario.
El licor madre HEPES utilizado para el cultivo celular debe someterse a un tratamiento de esterilización. Utilizando una membrana de poro de 0,22 micras para filtración y esterilización, las aguas madre preparadas se recogen en un recipiente estéril a través de un filtro estéril en una cabina de bioseguridad. El proceso de filtración debe mantener una presión adecuada o presión negativa para evitar daños a la membrana.
4. Uso y almacenamiento
El licor madre HEPES 1M preparado pertenece a una solución de reserva de alta concentración. En cultivo celular, la concentración de trabajo suele ser de 10 a 25 milimoles por litro, siendo la más utilizada 10 milimoles por litro. Esto significa que agregar 1 mililitro de licor madre por cada 100 mililitros de medio de cultivo puede lograr la concentración de trabajo. Se recomienda dividir el licor madre en porciones pequeñas para su almacenamiento para evitar la congelación y descongelación repetidas y la contaminación causada por la apertura. Las condiciones de almacenamiento generalmente son refrigeradas entre 2 y 8 grados centígrados y se debe prestar atención a etiquetar la fecha de preparación y el valor del pH.
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