En inmunoensayo de quimioluminiscencia, el éster de acridina es un marcador luminiscente directo ampliamente utilizado. Se utiliza para la detección de diversos elementos como hormonas, marcadores tumorales, inmunoglobulinas, etc. Sin embargo, desde polvos liofilizados hasta marcadores activos que pueden unirse de forma estable a proteínas o ácidos nucleicos, los procesos de disolución y marcado intermedios requieren un estricto control de las condiciones. Comprender y dominar estos puntos operativos es un requisito previo para obtener marcadores de alta actividad.
Condiciones de disolución y selección de disolventes no próticos
Los ésteres de acridina se suministran habitualmente en forma de polvo liofilizado y se almacenan en condiciones de baja temperatura y oscuridad. Cuando se utilizan, el primer paso es prepararlos en una solución. Aunque el éster de acridina se ha introducido con grupos antihidrólisis e hidrofílicos a través del diseño molecular, y el entorno de detección final también es una solución acuosa, el paso de disolución en sí mismo debe ser estrictamente anhidro. Esto se debe a que el ácido carboxílico en el extremo de la molécula de éster de acridina está unido a N-hidroxisuccinimida para formar un éster activado, que es muy sensible al agua. Si se disuelve directamente en un disolvente que contiene agua, el éster activado se hidrolizará prematuramente y perderá su capacidad de acoplarse a proteínas.
Por lo tanto, los ésteres de acridina deben disolverse utilizando disolventes no próticos. Las dos opciones más comunes son la N,N-dimetilformamida (DMF) y el dimetilsulfóxido (DMSO). La DMF y el DMSO pueden disolver eficazmente los ésteres de acridina sin participar en reacciones de transferencia de protones y sin dañar la estructura del éster activado. En DMF, la concentración de disolución del éster de acridina puede alcanzar aproximadamente 4 milimoles por litro; la solubilidad es mayor en DMSO, aproximadamente 10 miligramos por mililitro. Según la escala de marcado requerida para el experimento, se pueden seleccionar disolventes y volúmenes de disolución adecuados.
Reacción de marcado y formación de enlace amida
El grupo NHS unido a la molécula de éster de acridina es la clave de la reacción de marcado. Este grupo puede sufrir una reacción de sustitución nucleofílica con el grupo amino primario de las moléculas de proteína, formando enlaces amida estables en condiciones suaves mientras se elimina la N-hidroxisuccinimida. Una vez completada la reacción, el éster de acridina se une firmemente a la sustancia marcada a través de enlaces covalentes como enlaces amida o éster.
La eficiencia y especificidad de la reacción de marcado dependen de varios factores: el valor de pH del sistema de reacción, el tiempo de reacción y la relación molar de éster de acridina a la proteína alimentada. Por lo general, debe llevarse a cabo en condiciones débilmente alcalinas para promover el ataque nucleofílico del grupo amino, pero el pH no debe ser demasiado alto para evitar la hidrólisis o descomposición del éster de acridina en sí. Una vez completada la reacción, el conjugado marcado debe separarse del éster de acridina libre no reaccionado, generalmente utilizando métodos como columnas de desalinización o diálisis.
Almacenamiento y manipulación después del marcado
Después de formar un enlace covalente con la sustancia marcada, la estabilidad química del éster de acridina mejora significativamente en comparación con el éster activado libre. El conjugado marcado puede existir de forma estable en una solución tampón débilmente ácida. Especialmente para los derivados de éster de acridina que contienen grupos resistentes a la hidrólisis e hidrofílicos, incluso pueden permanecer estables en soluciones acuosas neutras.
Cabe señalar que la estructura luminiscente central del éster de acridina sigue siendo inestable en entornos alcalinos y oxidativos. Por lo tanto, el conjugado marcado debe almacenarse en un sistema tampón débilmente ácido y se debe excluir el oxígeno tanto como sea posible durante el almacenamiento y uso. Si es necesario, se puede utilizar gas nitrógeno para eliminar el oxígeno disuelto de la solución, evitando la luz para prolongar la vida útil del marcador.
Selección de varios derivados de éster de acridina
Hay más de un tipo de éster de acridina disponible para su selección. Los diferentes derivados tienen diferencias en hidrofilicidad y resistencia a la hidrólisis, y también se utilizan diferentes grupos de marcado para adaptarse a diferentes tipos de moléculas diana. Los productos marcados con ésteres de NHS son adecuados para la conjugación de aminas con proteínas; el ácido acridín carboxílico necesita acoplarse a proteínas a través de un agente condensante; la acrilamida hidrazida acopla polisacáridos que contienen aldehídos con ácidos nucleicos a través de grupos amino libres.
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