No imunoensaio de quimioluminescência, o éster de acridina é um marcador luminescente direto amplamente utilizado. É usado para a detecção de vários itens, como hormônios, marcadores tumorais, imunoglobulinas, etc. No entanto, desde pós liofilizados até marcadores ativos que podem se ligar de forma estável a proteínas ou ácidos nucleicos, os processos de dissolução e rotulagem intermediários exigem controle rigoroso das condições. Compreender e dominar estes pontos operacionais é um pré-requisito para a obtenção de marcadores altamente ativos.
Condições de dissolução e seleção de solventes não prótons
Os ésteres de acridina são geralmente fornecidos na forma de pó liofilizado e armazenados em baixa temperatura e no escuro. Quando em uso, o primeiro passo é prepará-lo em solução. Embora o éster de acridina tenha sido introduzido com grupos anti-hidrólise e hidrofílicos através de design molecular, e o ambiente de detecção final também seja uma solução aquosa, a etapa de dissolução em si deve ser estritamente anidra. Isto ocorre porque o ácido carboxílico no final da molécula do éster de acridina está ligado à N-hidroxisuccinimida para formar um éster ativado, que é altamente sensível à água. Se dissolvido diretamente num solvente contendo água, o éster ativado hidrolisará prematuramente e perderá a sua capacidade de se acoplar às proteínas.
Portanto, os ésteres de acridina devem ser dissolvidos utilizando solventes não protonados. As duas opções mais comumente usadas são N,N-dimetilformamida (DMF) e dimetilsulfóxido (DMSO). DMF e DMSO podem dissolver efetivamente ésteres de acridina sem participar de reações de transferência de prótons e sem danificar a estrutura do éster ativado. No DMF, a concentração de dissolução do éster de acridina pode atingir cerca de 4 milimoles por litro; A solubilidade é maior em DMSO, cerca de 10 miligramas por mililitro. De acordo com a escala de rotulagem necessária para o experimento, solventes e volumes de dissolução adequados podem ser selecionados.
Marcação de reação e formação de ligação amida
O grupo NHS ligado à molécula de éster de acridina é a chave para a reação de marcação. Este grupo pode sofrer reação de substituição nucleofílica com o grupo amino primário nas moléculas de proteína, formando ligações amida estáveis sob condições suaves enquanto remove a N-hidroxisuccinimida. Após a conclusão da reação, o éster de acridina está firmemente ligado à substância marcada através de ligações covalentes, como ligações amida ou ligações éster.
A eficiência e a especificidade da reação de marcação dependem de vários fatores: o valor do pH do sistema de reação, o tempo de reação e a proporção molar de éster de acridina para alimentação proteica. Normalmente, precisa ser realizado sob condições fracamente alcalinas para promover o ataque nucleofílico do grupo amino, mas o pH não deve ser muito alto para evitar a hidrólise ou decomposição do próprio éster de acridina. Após a reação estar completa, o conjugado marcado precisa ser separado do éster de acridina livre que não reagiu, geralmente usando métodos como colunas de dessalinização ou diálise.
Armazenamento e Manuseio após Marcação
Depois de formar uma ligação covalente com a substância marcada, a estabilidade química do éster de acridina é significativamente melhorada em comparação com o éster ativado livre. O conjugado marcado pode existir de forma estável em solução tampão fracamente ácida. Especialmente para derivados de éster de acridina contendo grupos hidrofílicos e resistentes à hidrólise, eles podem até permanecer estáveis em soluções aquosas neutras.
Deve-se notar que a estrutura luminescente central do éster de acridina ainda é instável em ambientes alcalinos e oxidativos. Portanto, o conjugado marcado deve ser armazenado num sistema tampão fracamente ácido e o oxigénio deve ser excluído tanto quanto possível durante o armazenamento e utilização. Se necessário, o gás nitrogênio pode ser usado para remover o oxigênio dissolvido da solução, evitando a luz para prolongar a vida útil do marcador.
Seleção de vários derivados de éster de acridina
Há mais de um tipo de éster de acridina disponível para seleção. Diferentes derivados têm diferenças na hidrofilicidade e resistência à hidrólise, e diferentes grupos de marcação também são usados para se adaptar a diferentes tipos de moléculas alvo. Os produtos marcados com ésteres NHS são adequados para conjugação de aminoácidos com proteínas; O ácido acridina carboxílico precisa ser acoplado às proteínas por meio de um agente de condensação; A acrilamida hidrazida acopla aldeídos contendo polissacarídeos com ácidos nucléicos por meio de grupos amino livres.
Compreender os requisitos de dissolução e os princípios de rotulagem dos ésteres de acridina é a base para a preparação bem-sucedida de marcadores quimioluminescentes. pode fornecer uma variedade de produtos de éster de acridina, incluindo ésteres NHS, ácidos carboxílicos de acridina e hidrazida de acridina, adequados para diferentes necessidades de rotulagem. Se você tiver alguma necessidade de compra recente, clique no site oficial da Desheng para saber mais detalhes!
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