Discussione sulla sterilizzazione ad alta temperatura del tampone HEPES

L'HEPES (4-idrossietilpiperazina acido etanesulfonico) è un tampone zwitterionico comunemente utilizzato negli esperimenti biomedici.Buffer HEPES: si può ottenere una soluzione sterile mediante sterilizzazione ad alta temperatura e ad alta pressione (ad esempio a 121 °C, 15-20 minuti)?La comprensione del comportamento dell'HEPES ad alte temperature può aiutare a evitare una diminuzione delle prestazioni di buffering o l'introduzione di fattori di interferenza sperimentali.

Caratteristiche di stabilità termica dell'HEPES

Dal punto di vista della struttura chimica, le molecole di HEPES contengono un anello di piperazina e una catena laterale di acido etanesulfonico.lo stato solido in polvere dell'HEPES è relativamente stabile e può essere conservato a lungoTuttavia, quando si dissolve in acqua e viene riscaldato al di sopra dei 100 °C, alcune molecole possono subire degradazione termica.Precedenti studi hanno dimostrato che la soluzione di HEPES può subire reazioni di idrolisi o ossidazione in condizioni di alta temperatura e pressionePer esempio, l'atomo di azoto sull'anello di piperazina può subire protonazione ad alte temperature,che portano a reazioni con ossigeno disciolto o altri componentiL'elevata temperatura può anche accelerare la complicazione dell'HEPES con ioni metallici in traccia come ferro e rame, che possono interferire con l'attività enzimatica o la crescita cellulare negli esperimenti successivi.

HEPES in polvere

Le osservazioni sperimentali reali hanno dimostrato che la soluzione tampone HEPES sterilizzata con vapore ad alta pressione a 121 °C subisce talvolta i seguenti cambiamenti:il colore della soluzione cambia da incolore a giallo chiaro o marrone chiaroIl valore del pH cambia (di solito diminuisce leggermente); appare un nuovo picco di assorbimento nello spettro di assorbimento UV nell'intervallo 240-300 nm.Questi fenomeni indicano la generazione di prodotti di degradazioneSebbene la concentrazione dei prodotti di degradazione sia generalmente bassa, questi cambiamenti possono avere impatti significativi su alcuni sistemi sperimentali altamente sensibili, quali la coltura cellulare, la coltura di cellule e la coltura di cellule.analisi della cinetica enzimatica, o analisi spettroscopica.

L'impatto della sterilizzazione ad alta temperatura sulla capacità di tamponamento

Oltre alla degradazione chimica, i processi ad alta temperatura possono modificare anche la capacità di tamponamento dell'HEPES. Il coefficiente di variazione del pKa dell'HEPES con la temperatura è di circa -0,014/°C,il che significa che quando la temperatura sale da 25 ° C a 121 ° CDopo la sterilizzazione ad alta temperatura, il tampone viene raffreddato a temperatura ambiente e il suo pKa può essere ripristinato.,questi prodotti possono avere caratteristiche di dissociazione diverse, con conseguente diminuzione della capacità tampone vicino al pH obiettivo.possono giudicare erroneamente la stabilità del pH del sistema sperimentale.

Metodo di sterilizzazione raccomandato

Dati i potenziali rischi di degradazione associati alla sterilizzazione ad alta temperatura e ad alta pressione, la maggior parte dei laboratori raccomanda di utilizzare metodi alternativi per il trattamento asettico del tampone HEPES.

La filtrazione e la sterilizzazione sono attualmente un metodo ampiamente utilizzato.22 μm di porosità di polietersulfone (PES) o membrana filtrante di acetato di cellulosa per filtrazione a pressione positiva o negativaLa filtrazione deve essere completata in un banco di lavoro pulito e il filtrato raccolto in un contenitore sterile.Questo metodo non comporta riscaldamento e può mantenere l'integrità chimica dell'HEPESSi deve notare che prima della filtrazione it should be confirmed that no other heat-resistant components (such as certain vitamins or reducing agents) have been added to the HEPES solution to avoid contaminating the filter membrane or affecting filtration efficiency.

Se la soluzione di HEPES è già stata preparata e non è strettamente richiesta la sterilità, la pastorizzazione può essere effettuata riscaldando in un bagno d'acqua a 80 °C per 30 minuti,che ha un effetto distruttivo sull'HEPES inferiore a quello della sterilizzazione ad alta pressione a vapore a 121 °CTuttavia, la pastorizzazione non può uccidere tutte le spore resistenti al calore, quindi non è adatta per esperimenti di coltura cellulare a lungo termine che richiedono una sterilità assoluta.

Imballaggio e congelamento: il liquido madre HEPES, dopo la filtrazione e la sterilizzazione, può essere suddiviso in tubi centrifugabili sterili e congelato a -20 o -80 °C.Scalzare ogni tubo una volta durante l'uso per evitare ripetuti congelamenti e scioglimenti, in quanto il processo di congelamento e scongelamento può causare leggeri spostamenti del pH o precipitazioni.

Conclusioni

Di solito non si raccomanda di sterilizzare la soluzione tampone di HEPES ad alta temperatura e pressione, in quanto a 121 °C può causare un certo grado di degradazione chimica.causando la decolorazione della soluzioneFiltrazione e sterilizzazione è un metodo affidabile per mantenere le prestazioni di HEPES.I ricercatori devono scegliere metodi di sterilizzazione e conservazione appropriati in base alle esigenze specifiche dell'esperimento e alla sensibilità alla purezza.Se è necessario un trattamento ad alta temperatura,la prova su piccola scala deve essere effettuata prima per valutare le prestazioni della soluzione tampone nel sistema sperimentale di destinazione prima e dopo la sterilizzazione., per confermare il livello accettabile.

Imballaggio del prodotto

Come produttore di tamponi HEPES,DeshengLa Commissione ha adottato un regolamento che stabilisce le norme per l'applicazione delle norme in materia di sicurezza alimentare.,Desheng ha ricevuto lode unanime dai clienti. Se avete intenzioni rilevanti, cliccate sul sito per chiedere dettagli e acquisto!