Discussão sobre a esterilização a alta temperatura do tampão HEPES

O HEPES (ácido 2-hidroxietilpiperazina-N'-2-ácido etanossulfônico) é um tampão zwitteriônico comumente usado em experimentos biomédicos. Muitos pesquisadores enfrentam uma escolha operacional ao preparar Tampão HEPES: uma solução estéril pode ser obtida por esterilização em alta temperatura e alta pressão (como 121 °C, 15-20 minutos)? Compreender o comportamento do HEPES em altas temperaturas pode ajudar a evitar a diminuição do desempenho do tamponamento ou a introdução de fatores de interferência experimental.

Além da degradação química, processos de alta temperatura também podem alterar a capacidade tamponante do HEPES. O coeficiente de variação do pKa do HEPES com a temperatura é de cerca de -0,014/°C, o que significa que quando a temperatura aumenta de 25 °C para 121 °C, o pKa diminuirá em cerca de 1,3 unidades. Após a esterilização em alta temperatura, o tampão é resfriado à temperatura ambiente e seu pKa pode ser restaurado. No entanto, se produtos de degradação forem gerados, esses produtos podem ter características de dissociação diferentes, resultando em uma diminuição da capacidade tamponante perto do pH alvo. Se os experimentadores não notarem essa mudança, eles podem julgar incorretamente a estabilidade do pH do sistema experimental.

Método de esterilização recomendado

Dadas as potenciais riscos de degradação associados à esterilização em alta temperatura e alta pressão, a maioria dos laboratórios recomenda o uso de métodos alternativos para tratamento asséptico de tampão HEPES.

A filtração e esterilização é atualmente um método amplamente utilizado. Prepare uma certa concentração de licor mãe de HEPES (por exemplo, 1 M, pH ajustado ao valor desejado) e use uma membrana de filtro de polissulfona (PES) ou acetato de celulose com tamanho de poro de 0,22 µm para filtração por pressão positiva ou negativa. A filtração deve ser concluída em uma bancada limpa e o filtrado deve ser coletado em um recipiente estéril. Este método não envolve aquecimento e pode manter a integridade química do HEPES. Deve-se notar que antes da filtração, deve-se confirmar que nenhum outro componente resistente ao calor (como certas vitaminas ou agentes redutores) foi adicionado à solução de HEPES para evitar a contaminação da membrana do filtro ou afetar a eficiência da filtração.

Evite aquecimento repetido. Se a solução de HEPES já foi preparada e a esterilidade não é estritamente necessária, a pasteurização pode ser realizada aquecendo em banho-maria a 80 °C por 30 minutos, o que tem um efeito destrutivo no HEPES menor do que a esterilização por vapor de alta pressão a 121 °C. No entanto, a pasteurização não pode matar todos os esporos resistentes ao calor, portanto, não é adequada para experimentos de cultura de células de longo prazo que exigem esterilidade absoluta.

Embalagem e congelamento. Para o licor mãe de HEPES após filtração e esterilização, ele pode ser dividido em tubos de centrífuga estéreis e congelado a -20 °C ou -80 °C. Descongele cada tubo uma vez durante o uso para evitar congelamento e descongelamento repetidos, pois o processo de congelamento e descongelamento pode causar leve desvio de pH ou precipitação.

Conclusão

A solução tampão HEPES geralmente não é recomendada para ser esterilizada sob alta temperatura e alta pressão, pois as condições de 121 °C podem causar um certo grau de degradação química, resultando em descoloração da solução, desvio de pH e diminuição da capacidade tamponante. A filtração e esterilização é um método confiável para manter o desempenho do HEPES. Os pesquisadores devem escolher métodos de esterilização e preservação apropriados com base nas necessidades específicas do experimento e na sensibilidade à pureza. Se o tratamento em alta temperatura for necessário, testes em pequena escala devem ser realizados primeiro para avaliar o desempenho da solução tampão no sistema experimental alvo antes e depois da esterilização, a fim de confirmar o nível aceitável.

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