La fotosensibilidad del HEPES 7365-45-9 y su impacto en los experimentos biológicos

HEPES (ácido 2-hidroxietilpiperazina-N'-2-etanosulfónico) es un zwitteriónico buffer biológico ampliamente utilizado en cultivo celular, química de proteínas y electrofisiología. Los investigadores a menudo eligen HEPES porque tienen capacidad de tamponamiento dentro del rango de pH fisiológico y no quelan iones metálicos divalentes. Sin embargo, una característica de HEPES - la fotosensibilidad - puede causar interferencias pasadas por alto durante el proceso experimental.

500g/botella, 25kg/bidón de cartón

M

Los experimentadores pueden reducir la interferencia causada por la fotosensibilidad de HEPES a través de varios métodos. En primer lugar, después de preparar la solución que contiene HEPES, use papel de aluminio o botellas de reactivos marrones para almacenarla en la oscuridad y evitar la exposición diaria a la luz. En segundo lugar, durante el cultivo y la operación celular, intente apagar las fuentes de iluminación innecesarias o usar tubos de luz amarilla con filtrado de longitud de onda de luz azul/ultravioleta. En tercer lugar, para observaciones a largo plazo (como imágenes de células vivas), se puede considerar el uso de un sistema buffer con menor fotosensibilidad, como PIPES (ácido piperazina-1,4-dietanosulfónico) o solución buffer de fosfato. PIPES tiene una capacidad significativamente menor para producir especies reactivas de oxígeno bajo luz que HEPES. En cuarto lugar, si HEPES no puede ser reemplazado en el experimento, se pueden agregar antioxidantes (como ácido lipoico, Trolox o piruvato de sodio) al buffer para eliminar el peróxido de hidrógeno generado por la exposición a la luz. Sin embargo, se debe tener en cuenta si los antioxidantes en sí mismos interfieren con el experimento. Quinto, al evaluar el impacto de HEPES, se puede establecer un control: la misma solución buffer se puede colocar bajo las mismas condiciones de iluminación, y luego se puede detectar la concentración de peróxido de hidrógeno o el efecto sobre la actividad de muestras estándar (como enzimas específicas) para determinar si la fotosensibilidad ha alcanzado un nivel inaceptable.

Hubei Xindesheng

Descubrimiento y mecanismo de la fotosensibilidad

Algunos laboratorios han observado que los medios de cultivo o los buffers que contienen HEPES pueden tener efectos adversos en ciertas células o biomoléculas cuando se exponen a la luz interior ordinaria o a lámparas fluorescentes. Investigaciones posteriores han demostrado que las propias moléculas de HEPES pueden sufrir reacciones fotoquímicas bajo condiciones de luz. Específicamente, después de que HEPES absorbe luz de una longitud de onda específica (especialmente luz azul o ultravioleta cercana en la región ultravioleta), el átomo de nitrógeno en su anillo de piperazina puede excitarse y reaccionar con el oxígeno disuelto para generar peróxido de hidrógeno. Mientras tanto, el proceso de reacción también puede generar especies reactivas de oxígeno como aniones superóxido y radicales hidroxilo. El fenómeno de la generación fotoinducida de especies reactivas de oxígeno es el mecanismo central de la fotosensibilidad de HEPES.

Buffer HEPES

El impacto en los sistemas biológicos

La generación de especies reactivas de oxígeno tiene impactos potenciales en diversas muestras biológicas. Por ejemplo, en el cultivo celular, incluso una iluminación a corto plazo de la mesa de operaciones puede llevar a la acumulación de peróxido de hidrógeno en el medio buffer de HEPES. El peróxido de hidrógeno puede inducir estrés oxidativo en las células, lo que lleva a una disminución de la viabilidad celular, apoptosis o activación anormal de las vías de señalización. Para neuronas primarias o ciertas líneas celulares sensibles, este efecto es más pronunciado. En la investigación de proteínas, las especies reactivas de oxígeno pueden oxidar residuos de metionina, tioles de cisteína o cadenas laterales de triptófano de las proteínas, lo que lleva a cambios en la actividad enzimática, agregación de proteínas o pérdida de epítopos antigénicos. Para experimentos de fluorescencia como imágenes de células vivas o ensayos de luciferasa, HEPES bajo iluminación no solo puede dañar las células, sino también apagar directamente los colorantes fluorescentes o causar un aumento en la fluorescencia de fondo, interfiriendo con la fiabilidad de los datos. Además, algunos experimentos que involucran estados redox pueden introducir señales de oxidación adicionales artificialmente bajo condiciones de luz si se utiliza HEPES, afectando así las conclusiones experimentales.

Medidas para evitar la influencia de la fotosensibilidadLos experimentadores pueden reducir la interferencia causada por la fotosensibilidad de HEPES a través de varios métodos. En primer lugar, después de preparar la solución que contiene HEPES, use papel de aluminio o botellas de reactivos marrones para almacenarla en la oscuridad y evitar la exposición diaria a la luz. En segundo lugar, durante el cultivo y la operación celular, intente apagar las fuentes de iluminación innecesarias o usar tubos de luz amarilla con filtrado de longitud de onda de luz azul/ultravioleta. En tercer lugar, para observaciones a largo plazo (como imágenes de células vivas), se puede considerar el uso de un sistema buffer con menor fotosensibilidad, como PIPES (ácido piperazina-1,4-dietanosulfónico) o solución buffer de fosfato. PIPES tiene una capacidad significativamente menor para producir especies reactivas de oxígeno bajo luz que HEPES. En cuarto lugar, si HEPES no puede ser reemplazado en el experimento, se pueden agregar antioxidantes (como ácido lipoico, Trolox o piruvato de sodio) al buffer para eliminar el peróxido de hidrógeno generado por la exposición a la luz. Sin embargo, se debe tener en cuenta si los antioxidantes en sí mismos interfieren con el experimento. Quinto, al evaluar el impacto de HEPES, se puede establecer un control: la misma solución buffer se puede colocar bajo las mismas condiciones de iluminación, y luego se puede detectar la concentración de peróxido de hidrógeno o el efecto sobre la actividad de muestras estándar (como enzimas específicas) para determinar si la fotosensibilidad ha alcanzado un nivel inaceptable.Embalaje del producto

Conclusión