Negli esperimenti di purificazione delle proteine, la scelta del tampone è importante, ma la selezione del tampone giusto non significa necessariamente che l'esperimento avrà successo. Nell'operatività pratica, il controllo della concentrazione del tampone, della temperatura, della forza ionica del sale e di altre condizioni influisce anche sull'effetto di purificazione. Tris HCl è uno dei sistemi tampone più utilizzati per la purificazione delle proteine, e ci sono molteplici passaggi di controllo che devono essere presi in considerazione durante il suo utilizzo.
Determinazione della concentrazione del tampone
Il Tris HCl deve svolgere un ruolo tampone efficace e la concentrazione è una condizione fondamentale. Sebbene la costante di dissociazione pKa del Tris abbia capacità tampone vicino al pH target, fare affidamento solo sull'intervallo tampone non è sufficiente. Se la concentrazione è troppo bassa, la quantità di cambiamenti acido-base che possono essere accomodati nel sistema è limitata e insufficiente a resistere alla deriva del pH che può verificarsi durante la purificazione delle proteine. Negli esperimenti di purificazione delle proteine, la concentrazione di lavoro del Tris HCl è solitamente selezionata tra 20 e 100 millimoli per litro. Al di sotto di questo intervallo, la capacità tampone potrebbe essere insufficiente; Al di sopra di questo intervallo, può essere introdotta un'eccessiva forza ionica, influenzando l'interazione tra la proteina e il mezzo cromatografico. La selezione specifica della concentrazione deve essere regolata in base al metodo di purificazione e alle caratteristiche della proteina.
L'effetto della temperatura sul valore del pH
Il tampone Tris HCl è sensibile ai cambiamenti di temperatura, che è una delle condizioni di controllo più facilmente trascurate nel suo utilizzo. Il pKa del Tris nel Tris HCl cambia con la temperatura, quindi il valore del pH regolato a una temperatura si sposterà a un'altra temperatura. Ad esempio, in una soluzione tampone regolata a pH 8,0 a 25 gradi Celsius, il pH aumenta effettivamente a circa 8,58 quando la temperatura scende a 5 gradi Celsius e diminuisce a circa 7,71 quando la temperatura sale a 37 gradi Celsius. Se il laboratorio conserva campioni di proteine a 4 gradi Celsius e prepara soluzioni tampone e regola il pH a temperatura ambiente, c'è una deviazione significativa tra i due. Nel lavoro pratico, il valore del pH della soluzione tampone deve essere regolato alla temperatura effettiva utilizzata nell'esperimento, o pre-regolato in base al coefficiente di correzione della temperatura.
Controllo della concentrazione degli ioni salini
Il tampone Tris HCl utilizzato negli esperimenti di purificazione delle proteine richiede solitamente l'aggiunta di cloruro di sodio per regolare la forza ionica. L'aggiunta di sale ha molteplici scopi: aumentare la forza ionica aiuta a mantenere la solubilità delle proteine e riduce le perdite dovute all'aggregazione proteica; Allo stesso tempo, è anche più vicino all'ambiente ionico in condizioni fisiologiche, il che è favorevole al mantenimento della conformazione naturale della proteina. La concentrazione comunemente utilizzata di cloruro di sodio è di circa 150 millimoli per litro, ma potrebbe essere necessario regolarla in diverse fasi di purificazione.
Nella cromatografia a scambio ionico, è richiesta una bassa concentrazione salina nella fase iniziale per ridurre il legame competitivo e adsorbire efficacemente la proteina target sul mezzo; Nella fase di eluizione, la proteina target viene spostata in modo competitivo aumentando la concentrazione salina attraverso un gradiente. Nella cromatografia di filtrazione su gel, un'adeguata concentrazione salina può aiutare a ridurre il legame non specifico e migliorare l'effetto di separazione. Nella cromatografia di affinità con ioni nichel, anche le concentrazioni saline del tampone di equilibrio e del tampone di lavaggio devono essere controllate ragionevolmente per ridurre il legame non specifico delle impurità.
Evitare l'interferenza dei fosfati
La composizione del tampone Tris HCl è relativamente semplice, ma è importante evitare di introdurre componenti incompatibili durante l'uso. I fosfati sono una delle sostanze incompatibili comuni e l'attività di alcune proteine (come le chinasi) può essere inibita dai fosfati. Se il fosfato viene miscelato nel campione o nel tampone, deve essere completamente rimosso mediante dialisi o cambiando il tampone prima che inizi la purificazione. Inoltre, l'acqua utilizzata per sciogliere la polvere di Tris e i reagenti utilizzati per preparare il tampone devono garantire la qualità ed evitare che le impurità interferiscano con il sistema di purificazione.
Il Tris HCl è un sistema tampone maturo e ampiamente utilizzato nella purificazione delle proteine, ma la sua efficacia dipende dal controllo ragionevole della concentrazione, della temperatura e della forza ionica del sale. Solo quando queste condizioni sono gestite correttamente, il Tris HCl può esercitare la sua funzione tampone e fornire una garanzia ambientale stabile per la purificazione delle proteine. Hubei Xindesheng Material Technology Co., Ltd. può fornire variagenti tampone biologicicome Tris, Bicine, MOPS, ecc. per soddisfare le esigenze di diversi sistemi di purificazione.
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