En los experimentos de purificación de proteínas, la elección del tampón es importante, pero la selección del tampón correcto no garantiza necesariamente el éxito del experimento. En la operación práctica, el control de la concentración del tampón, la temperatura, la fuerza iónica de la sal y otras condiciones también afectan el efecto de purificación. Tris HCl es uno de los sistemas de tampón de purificación de proteínas más utilizados, y hay varios pasos de control que deben tenerse en cuenta durante su uso.
Determinación de la concentración del tampón
El Tris HCl necesita desempeñar un papel de tamponamiento eficaz, y la concentración es una condición fundamental. Aunque la constante de disociación pKa del Tris tiene capacidad de tamponamiento cerca del pH objetivo, confiar únicamente en el rango de tamponamiento no es suficiente. Si la concentración es demasiado baja, la cantidad de cambios ácido-base que el sistema puede acomodar es limitada e insuficiente para resistir la deriva del pH que puede ocurrir durante la purificación de proteínas. En los experimentos de purificación de proteínas, la concentración de trabajo del Tris HCl se selecciona generalmente entre 20 y 100 milimoles por litro. Por debajo de este rango, la capacidad de tamponamiento puede ser insuficiente; Más allá de este rango, se puede introducir una fuerza iónica excesiva, lo que afecta la interacción entre la proteína y el medio de cromatografía. La selección de la concentración específica debe ajustarse según el método de purificación y las características de la proteína.
El efecto de la temperatura en el valor del pH
El tampón Tris HCl es sensible a los cambios de temperatura, lo que es una de las condiciones de control más fácilmente pasadas por alto en su uso. El pKa del Tris en Tris HCl cambia con la temperatura, por lo que el valor de pH ajustado a una temperatura se desplazará a otra temperatura. Por ejemplo, en una solución tampón ajustada a pH 8.0 a 25 grados Celsius, el pH aumenta a aproximadamente 8.58 cuando la temperatura desciende a 5 grados Celsius y disminuye a aproximadamente 7.71 cuando la temperatura aumenta a 37 grados Celsius. Si el laboratorio almacena muestras de proteínas a 4 grados Celsius y prepara soluciones tampón y ajusta el pH a temperatura ambiente, existe una desviación significativa entre ambas. En el trabajo práctico, el valor de pH de la solución tampón debe ajustarse a la temperatura real utilizada en el experimento, o preajustarse según el coeficiente de corrección de temperatura.
Control de la concentración de iones de sal
El tampón Tris HCl utilizado en experimentos de purificación de proteínas generalmente requiere la adición de cloruro de sodio para ajustar la fuerza iónica. La adición de sal tiene múltiples propósitos: aumentar la fuerza iónica ayuda a mantener la solubilidad de las proteínas y reduce las pérdidas causadas por la agregación de proteínas; Al mismo tiempo, también se acerca al entorno iónico en condiciones fisiológicas, lo que es propicio para mantener la conformación natural de la proteína. La concentración comúnmente utilizada de cloruro de sodio es de aproximadamente 150 milimoles por litro, pero puede ser necesario ajustarla en diferentes pasos de purificación.
En cromatografía de intercambio iónico, se requiere una menor concentración de sal en la etapa inicial para reducir la unión competitiva y adsorber eficazmente la proteína objetivo en el medio; En la etapa de elución, la proteína objetivo se desplaza competitivamente aumentando la concentración de sal a través de un gradiente. En cromatografía de filtración en gel, una concentración de sal apropiada puede ayudar a reducir la adsorción inespecífica y mejorar el efecto de separación. En cromatografía de afinidad con iones de níquel, las concentraciones de sal del tampón de equilibrio y del tampón de lavado también deben controlarse razonablemente para reducir la unión inespecífica de impurezas.
Evitar la interferencia de fosfatos
La composición del tampón Tris HCl es relativamente simple, pero es importante evitar la introducción de componentes incompatibles durante su uso. Los fosfatos son una de las sustancias incompatibles comunes, y la actividad de ciertas proteínas (como las quinasas) puede ser inhibida por los fosfatos. Si el fosfato se mezcla en la muestra o el tampón, debe eliminarse a fondo mediante diálisis o cambio de tampón antes de que comience la purificación. Además, el agua utilizada para disolver el polvo de Tris y los reactivos utilizados para preparar el tampón deben garantizar la calidad y evitar que las impurezas interfieran con el sistema de purificación.
El Tris HCl es un sistema de tampón maduro y ampliamente utilizado en la purificación de proteínas, pero su eficacia depende del control razonable de la concentración, la temperatura y la fuerza iónica de la sal. Solo cuando estas condiciones se manejan adecuadamente, el Tris HCl puede ejercer su función de tamponamiento y proporcionar una garantía ambiental estable para la purificación de proteínas. Hubei Xindesheng Material Technology Co., Ltd. puede proporcionar variosagentes de tamponamiento biológicocomo Tris, Bicina, MOPS, etc. para satisfacer las necesidades de diferentes sistemas de purificación.
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