Em experimentos de purificação de proteínas, a escolha do amortecedor é importante, mas a seleção do amortecedor certo não significa necessariamente que o experimento será bem sucedido.controlo da concentração do amortecedor, temperatura, força dos íons de sal e outras condições também afetam o efeito de purificação. Tris HClé um dos sistemas tampão de purificação de proteínas mais utilizados e existem várias etapas de controlo que devem ser tidas em conta durante a sua utilização.
Determinação da concentração do amortecedor
Embora a constante de dissociação de Tris, pKa, tenha capacidade de amortecimento perto do pH alvo,depender apenas do intervalo de amortecimento não é suficienteSe a concentração for demasiado baixa, a quantidade de alterações ácido-base que podem ser acomodadas no sistema é limitada e insuficiente para resistir à deriva do pH que pode ocorrer durante a purificação de proteínas..Em experimentos de purificação de proteínas, a concentração de trabalho de Tris HCl é geralmente escolhida entre 20 e 100 millimoles por litro.Para além deste intervalo, pode introduzir-se uma força iônica excessiva, afectando a interacção entre a proteína e o meio de cromatografia.A selecção da concentração específica deve ser ajustada em função do método de purificação e das características das proteínas..
O efeito da temperatura sobre o valor do pH
O tampão Tris HCl é sensível às alterações de temperatura, que é uma das condições de controlo mais facilmente negligenciadas na sua utilização.Assim, o valor do pH ajustado a uma temperatura irá mudar a outra temperaturaPor exemplo, em uma solução tampão ajustada a pH 8,0 a 25 graus Celsius, o pH aumenta para cerca de 8,58 quando a temperatura cai para 5 graus Celsius, e diminui para cerca de 7.71 quando a temperatura sobe para 37 graus CelsiusSe o laboratório armazenar amostras de proteínas a 4 graus Celsius e preparar soluções tampão e ajustar o pH à temperatura ambiente, há um desvio significativo entre os dois.O valor de pH da solução tampão deve ser ajustado à temperatura real utilizada no experimento., ou pré-ajustado de acordo com o coeficiente de correcção da temperatura.
Controle da concentração de iões de sal
O tampão Tris HCl usado em experimentos de purificação de proteínas geralmente requer a adição de cloreto de sódio para ajustar a força do íon.Aumento da resistência iónica ajuda a manter a solubilidade das proteínas e reduz as perdas causadas pela agregação de proteínasAo mesmo tempo, está também mais próximo do ambiente iónico em condições fisiológicas, o que favorece a manutenção da conformação natural da proteína.A concentração de cloreto de sódio comumente utilizada é de cerca de 150 millimoles por litro, mas pode ser necessário ajustá-lo em diferentes etapas de purificação.
Na cromatografia de troca de íons, é necessária uma concentração de sal mais baixa na fase inicial para reduzir a ligação competitiva e absorver eficazmente a proteína-alvo no meio;Na fase de elução, a proteína alvo é deslocada competitivamente aumentando a concentração de sal através de um gradiente.A concentração adequada de sal pode ajudar a reduzir a adsorção não específica e melhorar o efeito de separação.Na cromatografia de afinidade de íons de níquel, as concentrações de sal do tampão de equilíbrio e do tampão de lavagem também devem ser controladas de forma razoável para reduzir a ligação não específica das impurezas.
Evitar interferência de fosfatos
A composição do tampão Tris HCl é relativamente simples, mas é importante evitar a introdução de componentes incompatíveis durante a utilização.e a actividade de certas proteínas (como as quinases) pode ser inibida por fosfatosSe o fosfato for misturado na amostra ou no tampão, deve ser completamente removido por diálise ou alterado o tampão antes de começar a purificação.A água utilizada para dissolver o pó de Tris e os reagentes utilizados para preparar o tampão devem garantir a qualidade e evitar impurezas que interferam no sistema de purificação..
O Tris HCl é um sistema tampão maduro e amplamente utilizado na purificação de proteínas, mas a sua eficácia depende de um controlo razoável da concentração, temperatura e força dos íons de sal.Somente quando estas condições são devidamente tratadas, o Tris HCl pode exercer a sua função de amortecimento e proporcionar uma garantia ambiental estável para a purificação de proteínas.A Hubei Xindesheng Material Technology Co., Ltd. pode fornecer vários tipos de materiais.Agentes de amortecimento biológicosTris, Bicine, MOPS, etc., para satisfazer as necessidades de diferentes sistemas de purificação.
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