Schlüsselkontrolle der Tris-HCl-Pufferproteinreinigung

Bei Proteinreinigungsexperimenten ist die Auswahl des Puffers wichtig, aber die Auswahl des richtigen Puffers bedeutet nicht unbedingt, dass das Experiment erfolgreich ist.Kontrolle der Pufferkonzentration, Temperatur, Salz-Ionenstärke und andere Bedingungen beeinflussen ebenfalls die Reinigungseffekte. Tris HClist eines der am häufigsten verwendeten Puffersysteme zur Proteinreinigung, und es gibt mehrere Kontrollschritte, die bei seiner Verwendung berücksichtigt werden müssen.

Bestimmung der Pufferkonzentration

Tris HCl muss eine wirksame Pufferrolle spielen, und die Konzentration ist eine grundlegende Bedingung.Einzig auf den Pufferbereich angewiesen zu sein, reicht nicht aus.Wenn die Konzentration zu niedrig ist, ist die Menge der Säure-Basen-Veränderungen, die im System aufgenommen werden können, begrenzt und nicht ausreichend, um der pH-Drift zu widerstehen, die während der Proteinreinigung auftreten kann..Bei Proteinreinigungsexperimenten wird die Arbeitskonzentration von Tris HCl in der Regel zwischen 20 und 100 Millimole pro Liter gewählt.Über diesen Bereich hinaus, kann eine übermäßige Ionenstärke eingeführt werden, was die Wechselwirkung zwischen dem Protein und dem Chromatographiemedium beeinträchtigt.Die spezifische Konzentrationswahl muss entsprechend der Reinigungsmethode und den Proteinkennzahlen angepasst werden..

Der Einfluss der Temperatur auf den pH-Wert

Der Tris-HCl-Puffer ist empfindlich auf Temperaturänderungen reagierend, was eine der am leichtesten übersehenen Kontrollbedingungen bei seiner Anwendung ist.also wird sich der pH-Wert, der bei einer Temperatur angepasst wird, bei einer anderen Temperatur verschiebenZum Beispiel steigt der pH-Wert in einer auf pH 8,0 bei 25 Grad Celsius eingestellten Pufferlösung bei 5 Grad Celsius auf 8,58 und sinkt auf etwa 7.71 wenn die Temperatur auf 37 Grad Celsius steigtWenn das Labor Proteinproben bei 4 Grad Celsius speichert und Pufferlösungen herstellt und den pH-Wert bei Raumtemperatur anpasst, gibt es eine signifikante Abweichung zwischen den beiden.Der pH-Wert der Pufferlösung sollte an der tatsächlichen Temperatur des Experiments angepasst werden., oder entsprechend dem Temperaturkorrekturkoeffizienten vorbereitet.

Kontrolle der Salz-Ionenkonzentration

Tris-HCl-Puffer, die in Proteinreinigungsexperimenten verwendet werden, erfordern in der Regel die Zugabe von Natriumchlorid, um die Ionenstärke anzupassen.Erhöhung der Ionenfestigkeit hilft, die Löslichkeit von Proteinen aufrechtzuerhalten und Verluste durch Proteinaggregation zu reduzierenGleichzeitig ist es unter physiologischen Bedingungen auch näher an der Ionenumgebung, was der Aufrechterhaltung der natürlichen Konformation des Proteins fördert.Die allgemein verwendete Konzentration von Natriumchlorid beträgt etwa 150 Millimole pro Liter, aber es kann notwendig sein, sie in verschiedenen Reinigungsschritten anzupassen.

Bei der Ionenaustauschchromatographie ist in der Anfangsphase eine geringere Salzkonzentration erforderlich, um die Wettbewerbsbindung zu reduzieren und das Zielprotein effektiv auf das Medium zu adsorbieren.In der ElutionsphaseBei der Gelfiltrationschromatographie wird das Zielprotein durch Erhöhung der Salzkonzentration durch einen Gradienten wettbewerbsfähig verdrängt.Eine angemessene Salzkonzentration kann dazu beitragen, die unspezifische Adsorption zu reduzieren und den Separationseffekt zu verbessern.Bei der Nickel-Ionen-Affinitätschromatographie müssen auch die Salzkonzentrationen des Gleichgewichtspuffers und des Waschpuffers angemessen kontrolliert werden, um die unspezifische Bindung von Verunreinigungen zu verringern.

Vermeiden Sie Störungen durch Phosphate

Die Zusammensetzung des Tris-HCl-Puffers ist relativ einfach, aber es ist wichtig, während der Verwendung unvereinbare Bestandteile zu vermeiden.und die Aktivität bestimmter Proteine (wie Kinasen) durch Phosphate gehemmt werden kann.Wenn Phosphat in die Probe oder den Puffer gemischt wird, sollte es durch Dialyse oder durch Wechseln des Puffers vor Beginn der Reinigung gründlich entfernt werden.das Wasser zur Auflösung des Tris-Pulvers und die Reagenzien zur Zubereitung des Puffers sollten die Qualität gewährleisten und Verunreinigungen vermeiden, die das Reinigungssystem stören..

Tris HCl ist ein ausgereiftes und weit verbreitetes Puffersystem für die Proteinreinigung, dessen Wirksamkeit jedoch von einer angemessenen Kontrolle von Konzentration, Temperatur und Salz-Ionenstärke abhängt.Nur wenn diese Bedingungen ordnungsgemäß gehandhabt werden, kann Tris HCl seine Pufferfunktion ausüben und eine stabile Umweltgarantie für die Proteinreinigung bietenHubei Xindesheng Material Technology Co., Ltd. kann verschiedenebiologische PuffermittelWie z.B. Tris, Bicine, MOPS usw., um den Bedürfnissen verschiedener Reinigungssysteme gerecht zu werden.