Analizzare le interferenze di compatibilità HEPES 7365-45-9 nel sistema di rilevamento

L'HEPES, in quanto tampone biologico comunemente utilizzato, pur avendo una lieve attività chimica, può causare interferenze inaspettate nei risultati di test analitici specifici.Questo tipo di interferenza ha un forte occultamento, ma può diventare una fonte di pregiudizio dei dati.Buffer HEPESIn questo modo, la diffusione dei dati in diversi sistemi di rilevamento può contribuire a progettare in modo razionale le procedure sperimentali e migliorare la precisione analitica.

Caratteristiche di interferenza dei metodi di quantificazione delle proteine

Nei metodi BCA e Lowry, l'acido sulfonico e i gruppi aminati terziari nelle molecole HEPES possono formare complessi solubili con ioni di rame, consumando ioni di rame in modo competitivo nel sistema di reazione,risultante in una diminuzione del segnale a coloriQuando l'HEPES si trova al limite superiore dell'intervallo di concentrazione convenzionale, i valori misurati possono produrre risultati osservabili più bassi.e il grado di deviazione è in qualche modo correlato alla concentrazione del tamponeAl contrario, il metodo di Bradford si basa sul legame della Coomassie Brilliant Blue con le proteine ed è meno influenzato dall'interferenza HEPES.ma concentrazioni più elevate di HEPES possono comunque modificare la costante dielettrica della soluzione, causando piccole fluttuazioni. Pertanto, quando si effettua la quantificazione delle proteine, si raccomanda di utilizzare un campione standard con lo stesso sfondo tampone del campione per tracciare una curva standard,o per pre-desalinizzare il campione.

Buffer HEPES

Influenza sulla determinazione dell'attività enzimatica e sulla reazione di accoppiamento

La ricerca ha dimostrato che l'HEPES può partecipare a reazioni catalizzate da perossidasi,inibendo in una certa misura la loro efficienza catalitica e influenzando la determinazione della chemioluminescenza o degli endpoint colorimetrici basati sull'enzima- nei test con enzimi accoppiati, se nella prima fase della reazione si producono perossido di idrogeno o radicali liberi intermedi, l'HEPES può agire come spazzino o donatore di radicali liberi,modificando la velocità di reazione e causando una deviazione della lettura di assorbimento dal valore realePer gli esperimenti cinetici che richiedono il monitoraggio del consumo di substrato o della generazione di prodotto in questa banda, il HEPES è utilizzato per la produzione di sostanze chimiche.deve essere dedotto il buffer blank o deve essere utilizzato un sostituto con assorbimento ultravioletto più debole.

Potenziale interferenza con il rilevamento della fluorescenza e della chemioluminescenza

L'analisi della fluorescenza è sensibile alla composizione della soluzione e l'HEPES può produrre fluorescenza di fondo a alcune lunghezze d'onda di eccitazione, in particolare nella regione di eccitazione ultravioletta.Anche se l'intensità è inferiore a quella di alcuni agenti tamponanti tradizionaliPer gli esperimenti di fluorescenza a risoluzione temporale o di polarizzazione della fluorescenza, la frequenza di rilevamento delle radiazioni fluorescenti può essere inferiore a quella delle radiazioni fluorescenti a bassa abbondanza.L'HEPES può alterare l'indice di rifrazione e la viscosità della soluzioneNel rilevamento da chimioluminescenza, l'HEPES può decomporsi lentamente per produrre perossido di idrogeno in presenza di ioni di luce o di metalli di transizione.Questo sottoprodotto migliora o inibisce i sistemi luminescenti basati su esteri di luminolo o acridinaL'uso di tecniche di evitazione della luce e l'aggiunta di una quantità adeguata di agente chelante metallico possono contribuire ad alleviare tali interferenze.

Identificazione delle interferenze e contromisure sperimentali

Per determinare se l'HEPES interferisce con un sistema di rilevamento specifico, possono essere adottate due strategie di controllo: una è quella di impostare un controllo di corrispondenza di matrice,aggiunta di una concentrazione nota dello standard di sostanza bersaglio a un tampone contenente HEPES, e confrontando se il tasso di recupero rientra in un intervallo di deviazione accettabile.Il secondo metodo consiste nell'eseguire la convalida della diluizione o dello spostamento diluendo il campione con soluzione fisiologica salina senza agenti tamponanti e ripetendo il test.Se vi è una variazione non lineare nei risultati, indica interferenze da agenti tamponanti.si può considerare la riduzione della concentrazione di HEPES al livello più basso che soddisfi i requisiti di buffering, oppure sostituirlo con PIPES o EPPS con minori interferenze entro lo stesso intervallo di pH. Se è necessario utilizzare HEPES, esso può essere rimosso mediante dialisi o filtrazione in gel prima della determinazione,ma va notato che questa operazione può modificare la concentrazione del campione.

Raccomandazioni complete

Il problema della compatibilità dell'HEPES non è universale, ma può comportare una compensazione dei dati osservabili per metodi specifici.Gli sperimentatori dovrebbero valutare sistematicamente l'impatto del tipo di buffer e della concentrazione sull'endpoint di rilevamento quando stabiliscono nuovi metodi.La descrizione del livello di interferenza nelle diverse letterature varia spesso a causa delle differenze di condizioni.per cui è consigliabile allegare campioni di controllo qualità interno a ciascun lotto di sperimentazioni. attraverso una progettazione di controllo ragionevole e la necessaria pre-elaborazione, l'effetto di interferenza dell'HEPES può essere efficacemente controllato,garantendo così l'autenticità e la riproducibilità dei dati analizzati.

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