Analizar la interferencia de compatibilidad HEPES 7365-45-9 en el sistema de detección.

El HEPES, como amortiguador biológico de uso común, aunque tiene una actividad química leve, puede causar interferencias inesperadas en los resultados de ensayos analíticos específicos.Este tipo de interferencia tiene una fuerte ocultación, pero puede convertirse en una fuente de sesgo de datos.El buffer HEPESEn los sistemas de detección diferentes puede ayudar a diseñar procedimientos experimentales de manera racional y mejorar la precisión analítica.

Características de interferencia de los métodos de cuantificación de proteínas

En los métodos BCA y Lowry, el ácido sulfónico y los grupos aminados terciarios en las moléculas de HEPES pueden formar complejos solubles con iones de cobre, consumiendo iones de cobre de manera competitiva en el sistema de reacción,lo que resulta en una disminución de la señal de colorCuando el HEPES se encuentra en el límite superior del intervalo de concentración convencional, los valores medidos pueden producir resultados más bajos observables.y el grado de desviación está algo correlacionado con la concentración del amortiguadorEn cambio, el método Bradford se basa en la unión de Coomassie Brilliant Blue a las proteínas y se ve menos afectado por la interferencia de HEPES.pero las concentraciones más altas de HEPES pueden cambiar la constante dieléctrica de la soluciónPor lo tanto, al realizar la cuantificación de las proteínas, se recomienda utilizar una muestra estándar con el mismo fondo tampón que la muestra para trazar una curva estándar,o para desalinizar la muestra.

El buffer HEPES

Influencia en la determinación de la actividad enzimática y en la reacción de acoplamiento

La investigación ha demostrado que el HEPES puede participar en reacciones catalizadas por peroxidasa,Inhibición en cierta medida de su eficiencia catalítica e incidencia en la determinación de los parámetros de quimioluminiscencia o colorimetría basados en la enzimaEn los ensayos de enzimas acopladas, si se producen peróxido de hidrógeno o radicales libres intermedios en el primer paso de la reacción, el HEPES puede actuar como un limpiador o donante de radicales libres.alterando la velocidad de reacción y haciendo que la lectura de absorbancia se desvíe del valor realAdemás, el HEPES tiene una absorción débil en la banda ultravioleta corta.Se debe deducir el espacio en blanco del amortiguador o se debe utilizar un sustituto con una absorción ultravioleta más débil.

Interferencia potencial con la detección de fluorescencia y quimioluminiscencia

El análisis de fluorescencia es sensible a la composición de la solución, y HEPES puede producir fluorescencia de fondo en algunas longitudes de onda de excitación, especialmente en la región de excitación ultravioleta.Aunque la intensidad es inferior a la de algunos agentes tampones tradicionalesPara los experimentos de fluorescencia con resolución de tiempo o polarización de fluorescencia, el uso de una sonda fluorescente de baja abundancia puede ser un problema para la detección de las sondas fluorescentes.El HEPES puede alterar el índice de refracción y la viscosidad de la soluciónEn la detección por quimioluminiscencia, el HEPES puede descomponerse lentamente para producir peróxido de hidrógeno en presencia de iones de luz o metales de transición.Este subproducto mejora o inhibe los sistemas luminiscentes basados en ésteres de luminol o acridinaEl uso de técnicas para evitar la luz y la adición de una cantidad adecuada de agente quelante de metales pueden ayudar a aliviar dicha interferencia.

Identificación de las interferencias y contramedidas experimentales

Para determinar si el HEPES interfiere con un sistema de detección específico, se pueden adoptar dos estrategias de control.añadir una concentración conocida de la norma de la sustancia objetivo a un búfer que contenga HEPES, y comparando si la tasa de recuperación se encuentra dentro de un intervalo de desviación aceptable.El segundo método consiste en validar la dilución o el desplazamiento diluyendo la muestra con solución fisiológica salina sin agentes amortiguadores y volviendo a probar.Si hay un cambio no lineal en los resultados, indica interferencia de agentes tampones.puede considerarse reducir la concentración de HEPES al nivel más bajo que cumpla con los requisitos de amortiguación, o sustituirlo por PIPES o EPPS con menos interferencia dentro del mismo rango de pH. Si es necesario utilizar HEPES, puede eliminarse mediante diálisis o filtración por gel antes de la determinación,pero hay que tener en cuenta que esta operación puede cambiar la concentración de la muestra.

Recomendaciones completas

El problema de compatibilidad de HEPES no es universal, pero puede dar lugar a una compensación de datos observables para métodos específicos.Los experimentadores deben evaluar sistemáticamente el impacto del tipo de amortiguador y la concentración en el punto final de detección al establecer nuevos métodos.La descripción del nivel de interferencia en diferentes publicaciones varía a menudo debido a las diferencias de condiciones.Por lo tanto, es aconsejable adjuntar muestras de control de calidad interno a cada lote de experimentos.Mediante un diseño de control razonable y el necesario preprocesamiento, el efecto de interferencia del HEPES puede controlarse eficazmente.garantizando así la autenticidad y la reproducibilidad de los datos analizados.

Embalaje del producto

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