Spiegazione dettagliata del metodo di preparazione del tampone HEPES

HEPES è un tampone zwitterionico ampiamente utilizzato per le colture cellulari, in grado di mantenere un ambiente acido-base stabile entro l'intervallo di pH fisiologico. Preparazione ad alta concentrazioneTampone HEPESLe acque madri sono un'operazione di routine in laboratorio, ma ci sono dettagli a cui prestare attenzione in ogni passaggio. La qualità delle acque madri e l'affidabilità dei successivi esperimenti cellulari sono direttamente correlate agli standard operativi, dalla pesatura e dissoluzione alla regolazione del pH, dal volume costante alla filtrazione e sterilizzazione.

1. Pesatura e dissoluzione

Per preparare 1 litro di acqua madre HEPES 1M, è necessario pesare 238,3 grammi di polvere HEPES. Questo dosaggio è calcolato in base al peso molecolare di HEPES. Si consiglia di utilizzare una bilancia con sufficiente precisione durante la pesatura per evitare errori di pesatura che potrebbero causare una deviazione della concentrazione finale dal valore target.

Aggiungere la polvere HEPES pesata a circa 800 ml di acqua distillata. Va notato che HEPES ha scarsa solubilità in condizioni acide e potrebbe non dissolversi rapidamente quando aggiunto per la prima volta all'acqua. Porre il contenitore su un agitatore magnetico e mescolare continuamente fino a quando la soluzione diventa completamente limpida e trasparente, senza particelle non disciolte visibili ad occhio nudo. Questo processo richiede del tempo e non dovrebbe essere affrettato. Se la dissoluzione è lenta, il tempo di agitazione può essere opportunamente prolungato, ma non è necessario il riscaldamento perché HEPES può essere completamente disciolto a temperatura ambiente normale.

2. Regolazione del pH

La polvere HEPES stessa è debolmente acida e il pH della soluzione dopo la dissoluzione è molto inferiore all'intervallo target. Per l'aggiustamento della titolazione è necessaria una soluzione di idrossido di sodio. Di solito, la soluzione 1M di idrossido di sodio viene aggiunta lentamente alla soluzione HEPES agitata.

La regolazione del pH è la fase più paziente in questo processo di preparazione. La soluzione di idrossido di sodio deve essere aggiunta in lotti, mescolata accuratamente dopo ogni aggiunta e attendere che la lettura del pHmetro si stabilizzi prima di misurare. Quando ci si avvicina al pH target, è ancora più necessario aggiungere goccia a goccia per evitare eccessi. Per scopi di coltura cellulare, il pH target è solitamente impostato tra 7,3 e 7,4. Si consiglia di controllare il pH finale intorno a 7,35, poiché potrebbe verificarsi una leggera deriva del pH durante i successivi processi di filtrazione e conservazione.

La temperatura ha un impatto sulla misurazione del pH. Il valore del pH del tampone HEPES cambia con la temperatura e, se la temperatura della soluzione è significativamente più alta o più bassa della temperatura ambiente, la lettura misurata potrebbe discostarsi dal pH effettivo alla temperatura operativa target. Pertanto, prima di regolare il pH, la soluzione deve essere raffreddata o riscaldata a temperatura ambiente.

3. Volume e filtrazione costanti

Dopo aver aggiustato il pH, trasferire la soluzione in un matraccio tarato da 1 litro e diluire a volume con acqua distillata. Se il precedente processo di dissoluzione e regolazione del pH è stato effettuato in un becher, è necessario risciacquare più volte la parete interna del becher con una piccola quantità di acqua distillata per garantire che tutti i componenti HEPES vengano trasferiti nel matraccio tarato. Dopo aver impostato il volume è possibile confermare nuovamente il valore del pH e, se necessario, apportare piccole modifiche.

Le acque madri HEPES utilizzate per la coltura cellulare devono essere sottoposte a un trattamento di sterilizzazione. Utilizzando una membrana con pori da 0,22 micron per la filtrazione e la sterilizzazione, le acque madri preparate vengono raccolte in un contenitore sterile attraverso un filtro sterile in una cappa di biosicurezza. Il processo di filtrazione dovrebbe mantenere una pressione adeguata o una pressione negativa per evitare danni alla membrana.

4. Utilizzo e conservazione

L'acqua madre 1M HEPES preparata appartiene alla soluzione di riserva ad alta concentrazione. Nella coltura cellulare, la concentrazione di lavoro è solitamente compresa tra 10 e 25 millimoli per litro, mentre la concentrazione più comunemente utilizzata è 10 millimoli per litro. Ciò significa che aggiungendo 1 millilitro di acqua madre ogni 100 millilitri di terreno di coltura è possibile raggiungere la concentrazione di lavoro. Si consiglia di dividere l'acqua madre in piccole porzioni per la conservazione per evitare ripetuti congelamenti e scongelamenti e contaminazioni causate dall'apertura. Le condizioni di conservazione sono generalmente refrigerate a una temperatura compresa tra 2 e 8 gradi Celsius e occorre prestare attenzione all'etichettatura della data di preparazione e del valore del pH.

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