Ausführliche Erläuterung der Herstellungsmethode für den HEPES-Puffer

HEPES ist ein weit verbreiteter zwitterionischer Puffer für die Zellkultur, der eine stabile Säure-Basen-Umgebung im physiologischen pH-Bereich aufrechterhalten kann.HEPES-PufferMutterlikör ist eine Routineoperation im Labor, aber es gibt Details, auf die man bei jedem Schritt achten muss.Die Qualität des Mutterliquors und die Zuverlässigkeit der nachfolgenden Zellversuche hängen direkt mit den Betriebsnormen zusammen., vom Wiegen und Auflösen bis zur pH-Anpassung, vom konstanten Volumen bis zur Filtration und Sterilisation.

1Gewichtung und Auflösung

Um 1 Liter 1M HEPES-Mutterliquor herzustellen, müssen 238,3 Gramm HEPES-Pulver gewogen werden.Es wird empfohlen, beim Wiegen eine Waage mit ausreichender Genauigkeit zu verwenden, um Fehler beim Wiegen zu vermeiden, die dazu führen können, dass die Endkonzentration vom Zielwert abweicht..

Das gewichtete HEPES-Pulver wird ungefähr 800 ml destilliertes Wasser zugesetzt.Es ist zu beachten, dass HEPES unter säurehaltigen Bedingungen eine schlechte Löslichkeit aufweist und sich möglicherweise nicht schnell löst, wenn es zum ersten Mal in Wasser gegeben wird..Legen Sie den Behälter auf einen magnetischen Rührer und mischen Sie kontinuierlich, bis die Lösung vollständig klar und transparent wird, ohne dass mit bloßem Auge noch nicht gelöste Partikel sichtbar sind.Dieser Prozess dauert einige Zeit und sollte nicht überstürzt werdenWenn die Auflösung langsam ist, kann die Rührzeit angemessen verlängert werden, aber Heizung ist nicht erforderlich, da HEPES bei normaler Raumtemperatur vollständig aufgelöst werden kann.

2. pH-Anpassung

HEPES-Pulver selbst ist schwach sauer, und der pH-Wert der Lösung nach der Auflösung ist viel niedriger als der Zielbereich.1M Natriumhydroxidlösung wird der Rührlösung HEPES langsam zugesetzt.

Die pH-Anpassung ist der geduldigste Schritt in diesem Zubereitungsverfahren.und warten, bis sich der pH-Wert stabilisiert hat, bevor er gemessen wirdBei der Annäherung an den Ziel-pH-Wert ist es noch notwendiger, Tropfenweise hinzuzufügen, um einen Überschuss zu vermeiden.4Es wird empfohlen, den endgültigen pH-Wert bei etwa 7 zu kontrollieren.35, da bei späteren Filtrations- und Lagerungsprozessen eine leichte pH-Abweichung auftreten kann.

Der pH-Wert des HEPES-Puffers ändert sich mit der Temperatur, und wenn die Lösungstemperatur deutlich höher oder niedriger ist als die Raumtemperatur, wird der pH-Wert des HEPES-Puffers mit der Temperatur verändert.der gemessene Wert kann vom tatsächlichen pH-Wert bei der Zielbetriebstemperatur abweichenDaher sollte die Lösung vor der pH-Anpassung auf Raumtemperatur abgekühlt oder erhitzt werden.

3. Konstantes Volumen und Filtration

Nach der pH-Anpassung wird die Lösung in einen 1-Liter-Flaschenflasche überführt und mit destilliertem Wasser bis zur Markierung verdünnt.Wenn der vorherige Prozess der Auflösung und pH-Anpassung in einem Becher durchgeführt wurde, ist es notwendig, die Innenwand des Bechers mehrmals mit einer kleinen Menge destillierten Wassers zu spülen, um sicherzustellen, dass alle HEPES-Komponenten in den Volumenkolben übertragen werden.Nach Einstellung der Lautstärke, kann der pH-Wert erneut bestätigt und bei Bedarf geringfügig angepasst werden.

Die für die Zellkultur verwendeten HEPES-Mutterflüssigkeiten müssen einer Sterilisationsbehandlung unterzogen werden.der zubereitete Mutterliquor wird in einem sterilen Behälter durch einen sterilen Filter in einem Biosicherheitsschrank gesammeltDer Filtrationsprozess sollte einen angemessenen Druck oder einen negativen Druck aufrechterhalten, um Schäden an der Membran zu vermeiden.

4. Verwendung und Lagerung

Der hergestellte 1M HEPES-Mutterliquor gehört zu einer hochkonzentrierten Reservolösung, die in der Zellkultur in der Regel eine Arbeitskonzentration von 10 bis 25 Millimol pro Liter erreicht.wobei die am häufigsten verwendeten 10 Millimol pro Liter sindDies bedeutet, dass die Arbeitskonzentration erreicht werden kann, wenn 1 Milliliter Mutterlikör pro 100 Milliliter Kulturmedium hinzugefügt wird.Es wird empfohlen, den Mutterliquor in kleine Aufbewahrungsportionen zu teilen, um wiederholtes Einfrieren und Auftauen sowie Kontamination durch Öffnen zu vermeiden.Die Lagerbedingungen sind in der Regel bei 2 bis 8 Grad Celsius gekühlt, und es ist darauf zu achten, das Herstellungsdatum und den pH-Wert zu kennzeichnen.

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