Λεπτομερής επεξήγηση της μεθόδου παρασκευής ρυθμιστικού διαλύματος HEPES

Το HEPES είναι ένα ευρέως χρησιμοποιούμενο αμφιτεριονικό ρυθμιστικό διάλυμα για κυτταρική καλλιέργεια, το οποίο μπορεί να διατηρήσει ένα σταθερό περιβάλλον οξέος-βάσης εντός του φυσιολογικού εύρους pH. Προετοιμασία υψηλής συγκέντρωσηςρυθμιστικό διάλυμα HEPESΤο μητρικό ποτό είναι μια επέμβαση ρουτίνας στο εργαστήριο, αλλά υπάρχουν λεπτομέρειες που πρέπει να προσέχετε σε κάθε βήμα. Η ποιότητα του μητρικού υγρού και η αξιοπιστία των επόμενων κυτταρικών πειραμάτων σχετίζονται άμεσα με τα πρότυπα λειτουργίας, από τη ζύγιση και τη διάλυση έως τη ρύθμιση του pH, από τον σταθερό όγκο έως τη διήθηση και την αποστείρωση.

1. Ζύγισμα και διάλυση

Για την παρασκευή 1 λίτρου μητρικού υγρού HEPES 1M, πρέπει να ζυγιστούν 238,3 γραμμάρια σκόνης HEPES. Αυτή η δόση υπολογίζεται με βάση το μοριακό βάρος του HEPES. Συνιστάται η χρήση ζυγού με επαρκή ακρίβεια κατά τη ζύγιση για την αποφυγή σφαλμάτων ζύγισης που μπορεί να προκαλέσουν απόκλιση της τελικής συγκέντρωσης από την τιμή στόχο.

Προσθέστε τη ζυγισμένη σκόνη HEPES σε περίπου 800 χιλιοστόλιτρα απεσταγμένου νερού. Πρέπει να σημειωθεί ότι το HEPES έχει κακή διαλυτότητα σε όξινες συνθήκες και μπορεί να μην διαλυθεί γρήγορα όταν προστεθεί για πρώτη φορά στο νερό. Τοποθετήστε το δοχείο σε μαγνητικό αναδευτήρα και αναδεύστε συνεχώς μέχρι το διάλυμα να γίνει εντελώς διαυγές και διαφανές, χωρίς αδιάλυτα σωματίδια ορατά με γυμνό μάτι. Αυτή η διαδικασία διαρκεί λίγο και δεν πρέπει να βιαστεί. Εάν η διάλυση είναι αργή, ο χρόνος ανάδευσης μπορεί να παραταθεί κατάλληλα, αλλά δεν απαιτείται θέρμανση επειδή το HEPES μπορεί να διαλυθεί πλήρως σε κανονική θερμοκρασία δωματίου.

2. Ρύθμιση PH

Η ίδια η σκόνη HEPES είναι ασθενώς όξινη και το pH του διαλύματος μετά τη διάλυση είναι πολύ χαμηλότερο από το εύρος στόχου. Για τη ρύθμιση της τιτλοδότησης απαιτείται διάλυμα υδροξειδίου του νατρίου. Συνήθως, 1Μ διάλυμα υδροξειδίου του νατρίου προστίθεται αργά στο αναδευόμενο διάλυμα HEPES.

Η προσαρμογή του PH είναι το πιο υπομονετικό βήμα σε αυτή τη διαδικασία προετοιμασίας. Το διάλυμα υδροξειδίου του νατρίου πρέπει να προστίθεται σε παρτίδες, να αναδεύεται επιμελώς μετά από κάθε προσθήκη και να περιμένει να σταθεροποιηθεί η ένδειξη του pHόμετρο πριν από τη μέτρηση. Όταν πλησιάζετε το pH στόχο, είναι ακόμη πιο απαραίτητο να προσθέσετε στάγδην για να αποφύγετε την περίσσεια. Για σκοπούς κυτταροκαλλιέργειας, το pH στόχος τίθεται συνήθως μεταξύ 7,3 και 7,4. Συνιστάται ο έλεγχος του τελικού pH περίπου στο 7,35, καθώς ενδέχεται να υπάρξει μικρή μετατόπιση του pH κατά τη διάρκεια των επακόλουθων διεργασιών διήθησης και αποθήκευσης.

Η θερμοκρασία έχει αντίκτυπο στη μέτρηση του pH. Η τιμή του pH του ρυθμιστικού διαλύματος HEPES αλλάζει με τη θερμοκρασία και εάν η θερμοκρασία του διαλύματος είναι σημαντικά υψηλότερη ή χαμηλότερη από τη θερμοκρασία δωματίου, η μετρούμενη ένδειξη μπορεί να αποκλίνει από το πραγματικό pH στην στοχευόμενη θερμοκρασία λειτουργίας. Επομένως, πριν ρυθμίσετε το pH, το διάλυμα πρέπει να ψυχθεί ή να θερμανθεί σε θερμοκρασία δωματίου.

3. Σταθερός όγκος και διήθηση

Μετά τη ρύθμιση του pH, μεταφέρετε το διάλυμα σε ογκομετρική φιάλη 1 λίτρου και αραιώστε μέχρι τη χαραγή με απεσταγμένο νερό. Εάν η προηγούμενη διαδικασία διάλυσης και ρύθμισης του pH πραγματοποιήθηκε σε ποτήρι, είναι απαραίτητο να ξεπλύνετε το εσωτερικό τοίχωμα του ποτηριού με μικρή ποσότητα απεσταγμένου νερού πολλές φορές για να διασφαλίσετε ότι όλα τα συστατικά HEPES θα μεταφερθούν στην ογκομετρική φιάλη. Μετά τη ρύθμιση της έντασης, η τιμή του pH μπορεί να επιβεβαιωθεί ξανά και μπορούν να γίνουν μικρές ρυθμίσεις εάν είναι απαραίτητο.

Το μητρικό υγρό HEPES που χρησιμοποιείται για κυτταροκαλλιέργεια πρέπει να υποβληθεί σε επεξεργασία αποστείρωσης. Χρησιμοποιώντας μια μεμβράνη πόρων 0,22 micron για διήθηση και αποστείρωση, το παρασκευασμένο μητρικό υγρό συλλέγεται σε ένα αποστειρωμένο δοχείο μέσω ενός αποστειρωμένου φίλτρου σε ένα ερμάριο βιοασφάλειας. Η διαδικασία φιλτραρίσματος θα πρέπει να διατηρεί την κατάλληλη πίεση ή αρνητική πίεση για να αποφευχθεί η βλάβη της μεμβράνης.

4. Χρήση και αποθήκευση

Το μητρικό υγρό 1Μ HEPES που παρασκευάστηκε ανήκει σε αποθεματικό διάλυμα υψηλής συγκέντρωσης. Στην κυτταροκαλλιέργεια, η συγκέντρωση εργασίας είναι συνήθως 10 έως 25 millimoles ανά λίτρο, με τη συνηθέστερη χρήση να είναι 10 millimoles ανά λίτρο. Αυτό σημαίνει ότι η προσθήκη 1 χιλιοστόλιτρου μητρικού υγρού σε κάθε 100 χιλιοστόλιτρα μέσου καλλιέργειας μπορεί να επιτύχει τη συγκέντρωση εργασίας. Συνιστάται να χωρίζετε το μητρικό υγρό σε μικρές μερίδες για αποθήκευση για να αποφευχθεί η επαναλαμβανόμενη κατάψυξη και απόψυξη και η μόλυνση που προκαλείται από το άνοιγμα. Οι συνθήκες αποθήκευσης γενικά διατηρούνται στο ψυγείο στους 2 έως 8 βαθμούς Κελσίου και πρέπει να δίνεται προσοχή στην επισήμανση της ημερομηνίας παρασκευής και της τιμής του pH.

Η Hubei Xindesheng Material Technology Co., Ltd. έχει εμπλακεί βαθιά στον τομέα τηςβιολογικοί ρυθμιστικοί παράγοντεςκαι πρώτες ύλες διαγνωστικών αντιδραστηρίων για πολλά χρόνια, και έχει πάντα δεσμευτεί να παρέχει υψηλής καθαρότητας και αξιόπιστες πρώτες ύλες υψηλής ποιότητας για τη βιομηχανία διαγνωστικών in vitro. Τα προϊόντα της σειράς buffer HEPES που παράγονται από την εταιρεία υιοθετούν ακριβείς διαδικασίες σύνθεσης και καθαρισμού, ελέγχοντας αυστηρά κάθε βήμα από τις πρώτες ύλες έως τα τελικά προϊόντα, διασφαλίζοντας ότι τα προϊόντα έχουν εξαιρετικά υψηλή χημική καθαρότητα, εξαιρετική διαφάνεια διαλύματος και εξαιρετική συνοχή παρτίδων, ικανοποιώντας πλήρως τις απαιτήσεις παραγωγής των in vitro διαγνωστικών αντιδραστηρίων. Εάν έχετε πρόσφατες ανάγκες αγοράς, κάντε κλικ στον επίσημο ιστότοπο για να μάθετε περισσότερες λεπτομέρειες!