HEPES는 세포 배양에 널리 사용되는 zwitterionic 버퍼로 생리적 pH 범위 내에서 안정적인 산-기반 환경을 유지할 수 있습니다.HEPES 버퍼모유는 실험실에서의 일상적인 작업이지만 각 단계마다 주의해야 할 세부 사항이 있습니다.모액의 품질과 후속 세포 실험의 신뢰성은 운영 표준과 직접 관련이 있습니다., 무게와 용해에서 pH 조절, 일정한 부피에서 필터레이션과 살균까지.
1무게와 용해
1M HEPES 모액의 1 리터를 준비하려면 238.3 그램의 HEPES 분말이 무게가 필요합니다. 이 용량은 HEPES의 분자 중량에 따라 계산됩니다.최종 농도가 목표 값에서 벗어날 수 있는 무게 오류를 피하기 위해 무게를 ချိန် 때 충분한 정확도를 갖춘 저울을 사용하는 것이 좋습니다..
약 800 밀리리터의 증류 물에 무게가 된 HEPES 분자를 첨가합니다.HEPES는 산성 조건에서 용해성이 떨어지고 처음 물에 첨가되면 빨리 녹지 않을 수 있습니다.용기를 자기 혼합기에 올려놓고 용액이 완전히 맑고 투명해질 때까지 계속 섞고, 벌거벗은 눈으로 볼 수 있는 불분열 입자가 없습니다.이 과정 은 시간이 걸리고 서두르지 말아야 합니다용해가 느린 경우 섞는 시간을 적절하게 연장 할 수 있지만 HEPES는 정상적인 실온에서 완전히 용해 될 수 있기 때문에 가열이 필요하지 않습니다.
2PH 조절
HEPES 분말 자체는 희미하게 산성하며, 용해 된 후 용액의 pH는 목표 범위를 훨씬 낮습니다. 타이트레이션 조정에 나트륨 하이드록사이드 용액이 필요합니다. 일반적으로,1M 나트륨 하이드록시드 용액을 천천히 섞는 HEPES 용액에 첨가합니다..
PH 조절은 이 준비 과정의 가장 참을성 있는 단계입니다. 나트륨 하이드록시드 용액은 팩으로 첨가되어야 하며, 각 추가 후 철저히 섞어야 합니다.그리고 측정하기 전에 pH 미터의 판독이 안정되도록 기다립니다.목표 pH 에 접근 할 때, 과잉을 피하기 위해 방울씩 추가하는 것이 더욱 필요합니다. 세포 배양 목적으로 목표 pH 는 일반적으로 7.3에서 7 사이로 설정됩니다.4최종 pH 를 7 이내로 조절하는 것이 좋습니다.35, 후속 필터레이션 및 저장 과정에서 약간의 pH 변동이 발생할 수 있기 때문입니다.
온도는 pH 측정에 영향을 미칩니다. HEPES 버퍼의 pH 값은 온도에 따라 변하고 용액 온도가 방온보다 크게 높거나 낮으면측정된 값은 목표 작동 온도에서 실제 pH에서 벗어날 수 있습니다.따라서 pH를 조정하기 전에 용액을 실온으로 냉각하거나 가열해야합니다.
3일정한 부피와 필터링
pH 조절 후 용액을 1리터 용량 콜러로 옮겨 증류된 물로 표지판까지 희석합니다.이전 용해 및 pH 조절 과정이 컵에서 수행 된 경우, 모든 HEPES 구성 요소가 부피 콜러에 전달되도록 작은 양의 증류 물로 컵 내부 벽을 여러 번 씻어야합니다.부피를 설정 한 후, pH 값은 다시 확인 될 수 있으며 필요한 경우 약간의 조정이 가능합니다.
세포 배양에 사용되는 HEPES 모액은 살균 처리를 받아야 합니다.준비된 모액은 생체 안전 캐비닛에 있는 살균성 필터를 통해 살균성 용기에 수집됩니다.필터레이션 프로세스는 막 손상을 피하기 위해 적절한 압력 또는 마이너스 압력을 유지해야합니다.
4사용 및 보관
준비된 1M HEPES 모액은 고 농도의 예비 용액에 속합니다. 세포 배양에서 작업 농도는 일반적으로 1 리터 당 10 ~ 25 밀리몰입니다.가장 일반적으로 사용되는 것은 1 리터 당 10 밀리몰입니다.이것은 100 밀리리터 문화 매개체에 1 밀리리터 모병을 추가하면 작업 농도를 달성 할 수 있음을 의미합니다.모액을 저장하기 위해 작은 부분으로 나누는 것이 좋습니다. 반복적인 냉동과 녹기 및 열기 때문에 오염되는 것을 피하기 위해저장 조건은 일반적으로 2 ~ 8 °C에서 냉장 보관되며, 준비 날짜와 pH 값을 표시하는 데주의를 기울여야합니다.
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