El HEPES es un amortiguador zwitteriónico ampliamente utilizado para el cultivo celular, que puede mantener un ambiente ácido-base estable dentro del rango de pH fisiológico.El buffer HEPESEl licor madre es una operación de rutina en el laboratorio, pero hay detalles a los que hay que prestar atención en cada paso.La calidad del líquido madre y la fiabilidad de los experimentos celulares posteriores están directamente relacionadas con las normas de funcionamiento., desde el pesaje y la disolución hasta el ajuste del pH, desde el volumen constante hasta la filtración y la esterilización.
1Pesado y disuelto
Para preparar 1 litro de licor madre de 1M HEPES, se deben pesar 238,3 gramos de polvo de HEPES. Esta dosis se calcula sobre la base del peso molecular de HEPES.Se recomienda utilizar una balanza con una precisión suficiente al pesar para evitar errores de pesaje que puedan hacer que la concentración final se desvíe del valor objetivo..
Se añade el polvo de HEPES pesado a aproximadamente 800 ml de agua destilada.Debe tenerse en cuenta que el HEPES tiene una mala solubilidad en condiciones ácidas y puede no disolverse rápidamente cuando se añade por primera vez al agua.Coloque el recipiente en un agitador magnético y remueva continuamente hasta que la solución se vuelva completamente clara y transparente, sin partículas no disueltas visibles a simple vista.Este proceso lleva tiempo y no debe apresurarseSi la disolución es lenta, el tiempo de agitación puede ampliarse adecuadamente, pero no es necesario calentarlo porque el HEPES se puede disolver completamente a temperatura ambiente normal.
2Ajuste del pH
El polvo de HEPES en sí es débilmente ácido, y el pH de la solución después de la disolución es mucho menor que el rango objetivo.Se añade lentamente a la solución de HEPES 1M de hidróxido de sodio.
El ajuste del pH es el paso más paciente en este proceso de preparación.y esperar a que la lectura del medidor de pH se estabilice antes de medirCuando se aproxima al pH objetivo, es aún más necesario agregar a gota a gota para evitar el exceso.4Se recomienda controlar el pH final en torno a 7.35, ya que puede haber una ligera desviación del pH durante los procesos de filtración y almacenamiento posteriores.
La temperatura tiene un impacto en la medición del pH. El valor del pH del amortiguador HEPES cambia con la temperatura, y si la temperatura de la solución es significativamente superior o inferior a la temperatura ambiente,la lectura medida puede desviarse del pH real a la temperatura de funcionamiento objetivoPor lo tanto, antes de ajustar el pH, la solución debe enfriarse o calentarse a temperatura ambiente.
3Volumen y filtración constantes
Después de ajustar el pH, transferir la solución a un matraz volumétrico de 1 litro y diluir hasta la marca con agua destilada.Si el proceso anterior de disolución y ajuste del pH se realizó en un vaso, es necesario enjuagar varias veces la pared interna del vaso con una pequeña cantidad de agua destilada para garantizar que todos los componentes de HEPES se transfieren al matraz volumétrico.Después de ajustar el volumen, el valor del pH puede confirmarse nuevamente y, si es necesario, se pueden realizar ajustes menores.
El líquido madre HEPES utilizado para el cultivo celular debe someterse a un tratamiento de esterilización.el licor madre preparado se recoge en un recipiente estéril a través de un filtro estéril en un gabinete de bioseguridadEl proceso de filtración debe mantener una presión adecuada o una presión negativa para evitar daños en la membrana.
4Uso y almacenamiento
El licor madre 1M HEPES preparado pertenece a una solución de reserva de alta concentración.con el más comúnmente utilizado siendo 10 millimoles por litroEsto significa que añadiendo 1 ml de licor madre a cada 100 ml de medio de cultivo se puede alcanzar la concentración de trabajo.Se recomienda dividir el líquido base en pequeñas porciones para su almacenamiento para evitar la congelación y descongelación repetidas y la contaminación causada por la apertura.Las condiciones de almacenamiento son generalmente refrigeradas a 2 a 8 grados centígrados, y se debe prestar atención al etiquetado de la fecha de preparación y el valor del pH.
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