O HEPES é um tampão zwitteriónico amplamente utilizado para cultura celular, que pode manter um ambiente ácido-base estável dentro da faixa de pH fisiológico.Reservatório HEPESO licor-mãe é uma operação de rotina no laboratório, mas há detalhes a prestar atenção em cada etapa.A qualidade do líquido-mãe e a fiabilidade das experiências celulares subsequentes estão directamente relacionadas com as normas de funcionamento., da pesagem e dissolução ao ajuste do pH, do volume constante à filtragem e esterilização.
1Pesagem e dissolução
Para preparar 1 litro de 1M HEPES, é necessário pesar 238,3 gramas de HEPES em pó, calculada com base no peso molecular do HEPES.Recomenda-se utilizar uma balança com uma precisão suficiente ao pesar para evitar erros de pesagem que possam provocar um desvio da concentração final do valor-alvo..
Adicionar o pó de HEPES pesado a aproximadamente 800 ml de água destilada.Deve notar-se que o HEPES tem uma baixa solubilidade em condições ácidas e pode não dissolver-se rapidamente quando adicionado à água pela primeira vez.Colocar o recipiente num agitadoiro magnético e agitar continuamente até que a solução se torne completamente clara e transparente, sem partículas não dissolvidas visíveis a olho nu.Este processo leva algum tempo e não deve ser apressadoSe a dissolução for lenta, o tempo de agitação pode ser prolongado adequadamente, mas não é necessário aquecimento, porque o HEPES pode ser completamente dissolvido à temperatura ambiente normal.
2Ajuste do pH
O pó de HEPES em si é fraco ácido, e o pH da solução após a dissolução é muito menor que o intervalo alvo.A solução de hidróxido de sódio 1M é adicionada lentamente à solução HEPES de agitação.
O ajuste do pH é a etapa mais paciente neste processo de preparação.e esperar que a leitura do medidor de pH se estabilize antes de medirPara fins de cultura celular, o pH alvo é geralmente definido entre 7,3 e 7.4Recomenda-se controlar o pH final em torno de 7.35, uma vez que pode ocorrer uma ligeira variação do pH durante os processos subsequentes de filtragem e armazenagem.
A temperatura tem um impacto na medição do pH. O valor de pH do tampão HEPES varia com a temperatura e, se a temperatura da solução for significativamente superior ou inferior à temperatura ambiente,A leitura medida pode desviar-se do pH real à temperatura de funcionamento pretendidaPor conseguinte, antes de ajustar o pH, a solução deve ser arrefecida ou aquecida até à temperatura ambiente.
3Volume e filtragem constantes
Após ajuste do pH, transferir a solução para um frasco volumétrico de 1 litro e diluir até à marca com água destilada.Se o processo anterior de dissolução e ajuste do pH tiver sido realizado num copo, é necessário enxaguar várias vezes a parede interna do copo com uma pequena quantidade de água destilada para assegurar que todos os componentes do HEPES são transferidos para o frasco volumétrico.Depois de definir o volume, o valor do pH pode ser confirmado novamente e, se necessário, podem ser efectuados pequenos ajustamentos.
O líquido-mãe HEPES utilizado para a cultura celular deve ser submetido a tratamento de esterilização.O líquido-mãe preparado é recolhido num recipiente estéril através de um filtro estéril num gabinete de biossegurançaO processo de filtragem deve manter a pressão adequada ou a pressão negativa para evitar danos à membrana.
4. Utilização e Armazenagem
O licor-mãe 1M HEPES preparado pertence a uma solução de reserva de alta concentração.com a mais utilizada sendo de 10 millimoles por litroIsto significa que a adição de 1 mililitro de licor-mãe a cada 100 mililitros de meio de cultura pode alcançar a concentração de trabalho.Recomenda- se dividir o líquido-mãe em pequenas porções para armazenamento, a fim de evitar o congelamento e o descongelamento repetidos e a contaminação causada pela abertura.As condições de armazenagem são geralmente refrigeradas a 2 a 8 graus Celsius, devendo ser prestada atenção ao rótulo da data de preparação e do valor do pH.
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