Le HEPES est un tampon zwitterionique largement utilisé pour la culture cellulaire, qui peut maintenir un environnement acido-basique stable dans la plage de pH physiologique.Puffer HEPESLa liqueur mère est une opération de routine en laboratoire, mais il y a des détails à prendre en compte à chaque étape.La qualité de la liqueur mère et la fiabilité des expériences cellulaires ultérieures sont directement liées aux normes de fonctionnement., de la pesée et de la dissolution au réglage du pH, du volume constant à la filtration et à la stérilisation.
1. pesage et dissolution
Pour préparer 1 litre de liqueur mère 1M HEPES, 238,3 grammes de poudre HEPES doivent être pesés.Il est recommandé d'utiliser une balance avec une précision suffisante lors de la pesée afin d'éviter les erreurs de pesée susceptibles d'entraîner une déviation de la concentration finale par rapport à la valeur cible..
Ajouter la poudre de HEPES pesée à environ 800 millilitres d'eau distillée.Il convient de noter que le HEPES a une faible solubilité dans des conditions acides et peut ne pas se dissoudre rapidement lorsqu'il est ajouté pour la première fois à l'eau.Placez le récipient sur un agitateur magnétique et agitez continuellement jusqu'à ce que la solution devienne complètement claire et transparente, sans particules non dissoutes visibles à l' œil nu.Ce processus prend du temps et ne doit pas être précipité.Si la dissolution est lente, le temps de remuement peut être prolongé de manière appropriée, mais le chauffage n'est pas nécessaire car le HEPES peut être complètement dissous à température ambiante normale.
2. ajustement du pH
La poudre HEPES elle-même est faiblement acide, et le pH de la solution après dissolution est beaucoup plus bas que la plage cible.La solution d'hydroxyde de sodium 1M est ajoutée lentement à la solution de mélange HEPES.
L'ajustement du pH est l'étape la plus patiente de ce processus de préparation.et attendre que la mesure du pH du pH se stabilise avant de mesurerLorsque l'on approche du pH cible, il est encore plus nécessaire d'ajouter par goutte à goutte pour éviter l'excès.4Il est recommandé de contrôler le pH final autour de 7.35, car il peut y avoir une légère déviation du pH lors des processus de filtration et de stockage ultérieurs.
La température a une incidence sur la mesure du pH. La valeur du pH du tampon HEPES change avec la température et si la température de la solution est significativement supérieure ou inférieure à la température ambiante,la valeur mesurée peut s'écarter du pH réel à la température de fonctionnement ciblePar conséquent, avant de régler le pH, la solution doit être refroidie ou chauffée à température ambiante.
3. Volume et filtration constants
Après ajustement du pH, transférer la solution dans un flacon volumétrique de 1 litre et diluer à la marque avec de l'eau distillée.Si le procédé précédent de dissolution et de réglage du pH a été effectué dans un bol, il est nécessaire de rincer plusieurs fois la paroi intérieure du biberon avec une petite quantité d'eau distillée afin de s'assurer que tous les composants HEPES sont transférés dans le flacon volumétrique.Après avoir réglé le volume, la valeur du pH peut être confirmée à nouveau et des ajustements mineurs peuvent être effectués si nécessaire.
La liqueur mère HEPES utilisée pour la culture cellulaire doit être soumise à un traitement de stérilisation.la liqueur mère préparée est prélevée dans un récipient stérile à travers un filtre stérile dans un cabinet de biosécuritéLe processus de filtration doit maintenir une pression appropriée ou une pression négative pour éviter les dommages à la membrane.
4Utilisation et stockage
La liqueur mère 1M HEPES préparée appartient à une solution de réserve à haute concentration.dont la plus couramment utilisée est de 10 millimoles par litreCela signifie qu'en ajoutant 1 millilitre de liqueur mère à chaque 100 millilitres de culture, on peut atteindre la concentration de travail.Il est recommandé de diviser la liqueur mère en petites portions pour le stockage afin d'éviter la congélation et la décongélation répétées et la contamination causée par l'ouvertureLes conditions de stockage sont généralement réfrigérées à 2 à 8 degrés Celsius et l'étiquetage de la date de préparation et de la valeur du pH doit être pris en compte.
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