Toepassing van HEPES in cellencrawling- en transwellproeven

Celcrawling en Transwell-experimenten hebben een gemeenschappelijk probleem: beide zijn "meerdere stappen, lange periode" processen, en cellen en monsters moeten herhaaldelijk worden verwerkt in een niet-incubatoromgeving.De stabiliteit van de pH in dergelijke experimenten heeft vaak een grotere invloed op de resultaten dan veel mensen verwachten.

1.Gemeenschappelijke pijnpunten van twee soorten experimenten

Het proces van het monteren van de cellenlijst omvat meestal: zaaien op een dekselglas of lijst → kweek tot een geschikte toestand → wassen → fixeren → permeabiliseren → kleuren → afdichten van de lijst.Het wassen., fixatie en kleuring worden allemaal uitgevoerd op een schone bank of bij kamertemperatuur en de monsters worden herhaaldelijk uit de CO verwijderd.₂milieu.

Transwell-experimenten worden gebruikt voor migratie-, invasie- en cocultuurstudies: cellen worden in de bovenste kamer gezaaid en het cultuurmedium geeft chemotactische signalen aan de onderste kamer.Na een bepaalde tijdDe kleine kamer wordt verwijderd, de niet-migrerende cellen in de bovenste kamer worden gewist, vastgemaakt om te kleuren en geteld.en er zijn ook meerdere bemonstering en verwerking stappen in het midden.

Het probleem met beide is hetzelfde: elke keer als je de incubator verlaat, gaat het bicarbonaat buffer systeem kort uit.het kan ertoe leiden dat de celtoestand afwijkt van de verwachtingen.

hepes 500 g

2.De positie van HEPES in dergelijke processen

De buffercapaciteit vanHEPESis niet afhankelijk van CO in gasfase₂, met een pKa van ongeveer 7,5 (25°C) en een effectief bufferbereik van 6,8-8.2De in de technische gegevens van de fabrikant vermelde algemene toevoegingshoeveelheid is 10-25 mM.

In de crawling- en Transwell-processen wordt het voornamelijk op twee plaatsen gebruikt:

Cultuurmedium en werkingsvloeistof: HEPES-supplement in het cultuursysteem om de cellen in een stabiele pH-omgeving te houden bij verwerking buiten de doos

Was- en incubatieoplossingen: vervang of vul de conventionele PBS-wasoplossingen aan met HEPES-bevattende bufferoplossingen om pH-schommelingen tijdens wassen, kleuren en andere stappen te verminderen

Opgemerkt dient te worden dat dit soort toepassingen hetzelfde principe volgen als celcultuur: HEPES is een aanvulling, geen vervanging.Het oorspronkelijke natriumbicarbonaatsysteem in het basiskultuurmedium moet worden behouden., en beide moeten gecombineerd worden gebruikt.

3Drie operationele suggesties voor crawling-experimenten

3.1 Verkorten van de eenmalige blootstelling buiten de doos.en ze continu aan te vullen is effectiever dan alleen de bufferconcentratie te verhogenDit is het meest gemakkelijk te negeren en gemakkelijk te verbeteren.

3.2 Let vóór de fixatie op de pH van de wasoplossing.de pH stijgt met de CO-uitstoot₂Het gebruik van een bufferwasoplossing die HEPES bevat, kan deze stap beter beheersbaar maken.

3.3 Voorverwarmingsreagentia: reagentia bij lage temperatuur veroorzaken een extra temperatuurschok en veroorzaken bij combinatie met pH-veranderingen grotere storingen in de cellen.De gebruikelijke praktijk is om het wasmiddel en het fixatiemiddel vooraf in evenwicht te brengen met de werktemperatuur., maar het fixatiemiddel zelf heeft specifieke vereisten en dient de specifieke methode-instructies te volgen.

4Vier operationele suggesties voor het Transwell experiment

4.1 De vloeistofgehalte in de bovenste en onderste kamers moet gelijk zijn, dat is de basisvereiste voor Transwell experimenten.die van invloed zullen zijn op de migratie resultatenHet is ook niet bevorderlijk voor de CO-balans₂Het wordt aanbevolen na het toevoegen van de vloeistof visueel te controleren.

4.2 Let op de buffercapaciteit tijdens de lange incubatietijd.Indien gedurende deze periode meerdere tussentijdse waarnemingen vereist zijn, kan supplementen van HEPES pH-schommelingen verminderen.

4.3  De stappen van bemonstering en kleuring worden centraal verwerkt, net als bij het kruipen, de stappen van verwijderen, wissen, bevestigen, kleuren enz.Het is de bedoeling dat de parkeerplaatsen van de kleine kamer op een gecentraliseerde en continue manier worden voltooid om de tussenliggende parkeerplaatsen te verminderen..

4.4  De toevoeging van HEPES verhoogt de osmotische druk en de meeste zoogdierencellen kunnen 260-350 mOsm/kg verdragen.Het migratie-experiment is gevoelig voor de osmotische drukgradiënt., en na aanpassing van de formule moet NaCl worden gemeten en dienovereenkomstig worden aangepast.

5Twee gemeenschappelijke overwegingen

HEPES kan reactieve zuurstofsoorten zoals waterstofperoxide genereren onder zichtbaar licht.met name bij aanwezigheid van riboflavine in het kweekmediumDe kleurings- en observatiestappen gaan dikwijls gepaard met blootstelling aan licht en vloeistoffen die HEPES bevatten, moeten ver weg van licht worden bewaard.

De pH wordt gekalibreerd bij de werktemperatuur.°CHet wordt aanbevolen de pH-meter te kalibreren onder omstandigheden die dicht bij de werkelijke werktemperatuur liggen.

hepes-drumverpakkingen

De variabelen die betrokken zijn bij de crawling- en Transwell-experimenten zijn al talrijk, waarbij pH de meest gemakkelijk te overzien en gemakkelijk te verbeteren is.om cellen buiten de doos nog steeds buffercapaciteit te laten hebbenDe resultaten van deze twee maatregelen worden doorgaans zichtbaar verbeterd.

Hubei Xindesheng Material Technology Co., Ltd. is al lang gewijd aan het onderzoek en de productie vanbiologische bufferactiesHEPES en andere producten kunnen leverings- en aangepaste indicatoren bieden van gram tot ton.Het hoofdkantoor van het bedrijf is gevestigd in Guanggu United Science and Technology CityHet heeft twee R & D- en productiebases in Gedian en Huanggang (70 hectare), met een jaarlijkse productiecapaciteit van 5000 ton voor alle categorieën.De producten ervan worden gebruikt in in vitro-diagnostiek voor IVD, biomedische en dagelijkse chemische industrieën.