Aplicación de HEPES en Experimentos de Migración Celular y Transwell

Nombre del producto

Ácido 4-hidroxietilpiperazina etanosulfónico

QuímicoPolvo cristalino blancobbrevitura

Tampón HEPES

CASNúmero

7365-45-9

4.2 Prestar atención a la capacidad tamponadora durante el largo período de incubación. El tiempo de incubación para experimentos de migración/invasión suele ser de varias horas a decenas de horas. Si se requieren múltiples observaciones a mitad de camino durante este período, la suplementación con HEPES puede reducir las fluctuaciones de pH.pariencia del productoPolvo cristalino blancoPeso molecular

238.305Soluciones de lavado e incubación: Reemplazar o suplementar las soluciones de lavado PBS convencionales con soluciones tampón que contienen HEPES para reducir las fluctuaciones de pH durante el lavado, la tinción y otros pasosC8H18N2O4S4.2 Prestar atención a la capacidad tamponadora durante el largo período de incubación. El tiempo de incubación para experimentos de migración/invasión suele ser de varias horas a decenas de horas. Si se requieren múltiples observaciones a mitad de camino durante este período, la suplementación con HEPES puede reducir las fluctuaciones de pH.1.07 g/mL a 20 °C

5. Dos consideraciones comunesEmbalaje estándarCondiciones de almacenamientoTemperatura ambiente, protegido de la luz y la humedad

Pureza

5. Dos consideraciones comunesEmbalaje estándar500g/botella, 25kg/bidón de cartónFabricante

Hubei Xindesheng

1. Puntos débiles comunes de dos tipos de experimentosEl proceso de montaje de portaobjetos celulares generalmente incluye: siembra en un cubreobjetos o portaobjetos → cultivo a un estado apropiado → lavado → fijación → permeabilización → tinción → sellado del portaobjetos. Los pasos de lavado, fijación y tinción se completan en una campana de extracción o a temperatura ambiente, y las muestras se retiran repetidamente del entorno de CO₂.

Los experimentos de Transwell se utilizan para estudios de migración, invasión y cocultivo: las células se siembran en la cámara superior y el medio de cultivo proporciona señales quimiotácticas a la cámara inferior. Después de un cierto período de tiempo, se retira la cámara pequeña, se eliminan las células no migratorias en la cámara superior, se fijan para teñir y se cuentan. El período de incubación de todo el proceso es largo, y también hay múltiples pasos de muestreo y procesamiento en el medio.

5. Dos consideraciones comunes hepes 500g4.2 Prestar atención a la capacidad tamponadora durante el largo período de incubación. El tiempo de incubación para experimentos de migración/invasión suele ser de varias horas a decenas de horas. Si se requieren múltiples observaciones a mitad de camino durante este período, la suplementación con HEPES puede reducir las fluctuaciones de pH.La capacidad tamponadora de HEPES no depende del CO₂ en fase gaseosa, con un pKa de aproximadamente 7.5 (25 °C) y un rango de tamponamiento efectivo de 6.8-8.2, que coincide con el rango de crecimiento de las células de mamífero. La cantidad de adición general dada en los datos técnicos del fabricante es de 10-25 mM.

En los procesos de arrastre y Transwell, se utiliza principalmente en dos lugares:

Medio de cultivo y líquido de operación: Suplementar HEPES en el sistema de cultivo para mantener las células en un entorno de pH estable cuando se procesan fuera de la cajaSoluciones de lavado e incubación: Reemplazar o suplementar las soluciones de lavado PBS convencionales con soluciones tampón que contienen HEPES para reducir las fluctuaciones de pH durante el lavado, la tinción y otros pasosCabe señalar que este tipo de aplicación sigue el mismo principio que el cultivo celular: HEPES es un suplemento, no un reemplazo. Se debe conservar el sistema de bicarbonato de sodio original del medio de cultivo básico, y ambos deben usarse en combinación.

3. Tres sugerencias operativas para experimentos de arrastre

4.2 Prestar atención a la capacidad tamponadora durante el largo período de incubación. El tiempo de incubación para experimentos de migración/invasión suele ser de varias horas a decenas de horas. Si se requieren múltiples observaciones a mitad de camino durante este período, la suplementación con HEPES puede reducir las fluctuaciones de pH.3.2 Prestar atención al pH de la solución de lavado antes de la fijación. Si se utiliza un líquido sin capacidad tamponadora para el lavado antes de la fijación, o si el líquido se deja al aire durante demasiado tiempo, el pH subirá con la fuga de CO₂. El uso de una solución de lavado tampón que contenga HEPES puede hacer que este paso sea más controlable.

3.3 Precalentamiento de reactivos. Los reactivos a baja temperatura provocarán un shock térmico adicional y, cuando se combinen con cambios de pH, causarán una mayor perturbación a las células. La práctica convencional es equilibrar el detergente y el fijador a la temperatura de operación con antelación, pero el fijador en sí tiene requisitos específicos y debe seguir las instrucciones del método específico.

4. Cuatro sugerencias operativas para el experimento Transwell4.1 Mantener los niveles de líquido en las cámaras superior e inferior consistentes. Este es el requisito básico para los experimentos de Transwell. La diferencia de nivel de líquido formará presión hidrostática adicional, que afectará los resultados de migración; tampoco es propicio para el equilibrio de CO₂ y pH entre las cámaras superior e inferior. Se recomienda verificar visualmente después de añadir el líquido.4.2 Prestar atención a la capacidad tamponadora durante el largo período de incubación. El tiempo de incubación para experimentos de migración/invasión suele ser de varias horas a decenas de horas. Si se requieren múltiples observaciones a mitad de camino durante este período, la suplementación con HEPES puede reducir las fluctuaciones de pH.4.3 Los pasos de muestreo y tinción se procesan de forma centralizada. Similar al arrastre, los pasos de retirada, borrado, fijación, tinción, etc. de la cámara pequeña se completan de forma centralizada y continua para reducir el estacionamiento intermedio.

4.4 Revisar la presión osmótica. La adición de HEPES aumentará la presión osmótica, y la mayoría de las células de mamífero pueden tolerar 260-350 mOsm/kg. El experimento de migración es sensible al gradiente de presión osmótica, y después de ajustar la fórmula, el NaCl debe medirse y ajustarse en consecuencia.

5. Dos consideraciones comunesEvitar la luz durante todo el proceso. HEPES puede generar especies reactivas de oxígeno como peróxido de hidrógeno bajo irradiación de luz visible, especialmente en presencia de riboflavina en el medio de cultivo. Los pasos de tinción y observación a menudo van acompañados de exposición a la luz, y los líquidos que contienen HEPES deben almacenarse protegidos de la luz.

El pH se calibra a la temperatura de operación. El coeficiente de temperatura del pKa de HEPES es de aproximadamente -0.014/°C. Se recomienda calibrar el pHmetro en condiciones cercanas a la temperatura de operación real.