Aplicação do HEPES em experimentos de rastreamento celular e transwell

O rastreamento de células e os experimentos Transwell têm um problema comum: ambos são processos de "várias etapas e longo período", e as células e amostras precisam ser processadas repetidamente em um ambiente sem incubadora. A estabilidade do pH em tais experimentos geralmente tem um impacto maior nos resultados do que muitas pessoas imaginam.

1. Pontos problemáticos comuns de dois tipos de experimentos

O processo de montagem da lâmina celular geralmente inclui: semeadura em uma lamínula ou lâmina → cultura até um estado apropriado → lavagem → fixação → permeabilização → coloração → selagem da lâmina. As etapas de lavagem, fixação e coloração são concluídas em uma bancada limpa ou em temperatura ambiente, e as amostras são removidas repetidamente do CO₂ambiente.

Experimentos Transwell são usados ​​para estudos de migração, invasão e co-cultura: as células são semeadas na câmara superior e o meio de cultura fornece sinais quimiotáticos para a câmara inferior. Após um certo período de tempo, a câmara pequena é removida, as células não migratórias na câmara superior são apagadas, fixadas para coloração e contadas. O período de incubação de todo o processo é longo e também há várias etapas de amostragem e processamento no meio.

O problema com ambos é o mesmo: toda vez que você sai da incubadora, o sistema tampão de bicarbonato falha brevemente. O impacto em passos curtos é limitado, mas quando acumulado, pode fazer com que o estado da célula se desvie das expectativas.

hepes 500g

2.A posição da HEPES em tais processos

A capacidade de buffer deHEPESnão depende de CO em fase gasosa₂, com pKa de aproximadamente 7,5 (25℃) e uma faixa de tamponamento eficaz de 6,8-8,2, que coincide com a faixa de crescimento de células de mamíferos. A quantidade geral de adição indicada nos dados técnicos do fabricante é de 10-25 mM.

Nos processos crawling e Transwell, é utilizado principalmente em dois locais:

Meio de cultura e fluido operacional: Suplemento HEPES no sistema de cultura para manter as células em um ambiente de pH estável quando processadas fora da caixa

Soluções de lavagem e incubação: Substitua ou complemente as soluções de lavagem convencionais de PBS por HEPES contendo soluções tampão para reduzir as flutuações de pH durante a lavagem, coloração e outras etapas

Ressalta-se que esse tipo de aplicação segue o mesmo princípio da cultura celular: o HEPES é um suplemento, não um substituto. O sistema original de bicarbonato de sódio no meio de cultura básico deve ser mantido e os dois devem ser usados ​​em combinação.

3.Três sugestões operacionais para experimentos de rastreamento

3.1 Encurte a exposição única fora da caixa. Preparar antecipadamente os reagentes para as etapas de lavagem, fixação e permeabilização, pré-aquecê-los no local e concluí-los continuamente é mais eficaz do que simplesmente aumentar a concentração do tampão. Este é o mais facilmente esquecido e melhorado.

3.2 Preste atenção ao pH da solução de lavagem antes da fixação. Se um líquido sem capacidade tampão for usado para lavagem antes da fixação, ou se o líquido for deixado no ar por muito tempo, o pH aumentará com o escape de CO₂. Usar uma solução tampão de lavagem contendo HEPES pode tornar esta etapa mais controlável.

3.3 Pré-aquecimento de reagentes. Os reagentes de baixa temperatura trarão choques térmicos adicionais e, quando combinados com alterações de pH, causarão maior perturbação nas células. A prática convencional é equilibrar antecipadamente o detergente e o fixador com a temperatura de operação, mas o fixador em si tem requisitos específicos e deve seguir as instruções específicas do método.

4.Quatro sugestões operacionais para o experimento Transwell

4.1 Mantenha consistentes os níveis de líquido nas câmaras superior e inferior. Este é o requisito básico para experimentos Transwell. A diferença de nível do líquido formará pressão hidrostática adicional, o que afetará os resultados da migração; Também não é propício ao equilíbrio de CO₂e pH entre as câmaras superior e inferior. Recomenda-se verificar visualmente após adicionar o líquido.

4.2 Preste atenção à capacidade tampão durante o longo período de incubação. O tempo de incubação para experimentos de migração/invasão é geralmente de várias horas a dezenas de horas. Se forem necessárias múltiplas observações de médio prazo durante este período, a suplementação de HEPES pode reduzir as flutuações de pH.

4.3  As etapas de amostragem e coloração são processadas centralmente. Semelhante ao rastejamento, as etapas de remoção, apagamento, fixação, coloração, etc. da pequena câmara são concluídas de forma centralizada e contínua para reduzir o estacionamento intermediário.

4.4  Revise a pressão osmótica. A adição de HEPES aumentará a pressão osmótica e a maioria das células de mamíferos pode tolerar 260-350 mOsm/kg. O experimento de migração é sensível ao gradiente de pressão osmótica e, após ajustar a fórmula, o NaCl deve ser medido e ajustado de acordo.

5. Duas considerações comuns

Evite luz durante todo o processo. HEPES pode gerar espécies reativas de oxigênio, como o peróxido de hidrogênio, sob irradiação de luz visível, especialmente na presença de riboflavina no meio de cultura. As etapas de coloração e observação são frequentemente acompanhadas de exposição à luz, e os líquidos contendo HEPES devem ser armazenados longe da luz

O PH é calibrado na temperatura operacional. O coeficiente de temperatura pKa do HEPES é aproximadamente -0,014/℃. Recomenda-se calibrar o medidor de pH em condições próximas da temperatura real de operação

embalagem de tambor hepes

As variáveis ​​envolvidas nos experimentos de rastreamento e Transwell já são numerosas, sendo o pH a mais facilmente ignorada e facilmente melhorada. Existem apenas duas abordagens principais: permitir que as células ainda tenham capacidade de buffer quando fora da caixa e compactar as etapas fora da caixa no menor comprimento possível. Ao implementar estas duas medidas de forma eficaz, há normalmente uma melhoria visível na consistência dos resultados.

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