Εφαρμογή του HEPES σε πειράματα κυτταρικής σάρωσης και transwell

Τα πειράματα κυψελών και τα πειράματα Transwell έχουν ένα κοινό πρόβλημα: και τα δύο είναι διαδικασίες "πολλαπλών βημάτων, μακράς περιόδου" και τα κύτταρα και τα δείγματα πρέπει να υποβάλλονται σε επαναλαμβανόμενη επεξεργασία σε περιβάλλον που δεν είναι θερμοκοιτίδα.Η σταθερότητα του pH σε τέτοια πειράματα έχει συχνά μεγαλύτερη επίδραση στα αποτελέσματα από ό,τι πολλοί άνθρωποι προβλέπουν.

1.Συνήθιστα σημεία πόνου δύο τύπων πειραμάτων

Η διαδικασία της τοποθέτησης των κυψελών συνήθως περιλαμβάνει: τοποθέτηση σε γυαλί κάλυψης ή σε λάστιχο → καλλιέργεια σε κατάλληλη κατάσταση → πλύση → στερέωση → διαπερατότητα → χρωματισμό → σφράγιση του λάστιχου.Το πλυντήριο.Τα βήματα στερέωσης και χρωματισμού ολοκληρώνονται σε καθαρό πάγκο ή σε θερμοκρασία δωματίου και τα δείγματα αφαιρούνται επανειλημμένα από το CO.₂περιβάλλοντος.

Τα πειράματα Transwell χρησιμοποιούνται για μελέτες μετανάστευσης, εισβολής και συν-καλλιέργειας: τα κύτταρα σπέρνονται στον άνω θάλαμο και το μέσο καλλιέργειας παρέχει χημειοταξικά σήματα στον κατώτερο θάλαμο.Μετά από ένα ορισμένο χρονικό διάστημαΗ περίοδος επώασης ολόκληρης της διαδικασίας είναι μεγάλη.και υπάρχουν επίσης πολλαπλά βήματα δειγματοληψίας και επεξεργασίας στη μέση.

Το πρόβλημα με τα δύο είναι το ίδιο: κάθε φορά που βγαίνεις από την εκκολαπτική μονάδα, το σύστημα αποθήκευσης βυθού αποτυγχάνει για λίγο.μπορεί να προκαλέσει την απόκλιση της κυτταρικής κατάστασης από τις προσδοκίες.

Επικίνδυνα

2Η θέση του HEPES σε τέτοιες διαδικασίες

Η ικανότητα αποθήκευσης τουHEPESδεν εξαρτάται από το CO της αέριας φάσης₂, με pKa περίπου 7, 5 (25°C) και ένα αποτελεσματικό εύρος αποθήκευσης 6,8-8.2Η γενική πρόσθετη ποσότητα που αναφέρεται στα τεχνικά δεδομένα του κατασκευαστή είναι 10-25 mM.

Στις διεργασίες σάρωσης και Transwell, χρησιμοποιείται κυρίως σε δύο σημεία:

Μέσο καλλιέργειας και υγρό λειτουργίας: συμπλήρωμα HEPES στο σύστημα καλλιέργειας για τη διατήρηση των κυττάρων σε σταθερό περιβάλλον pH κατά την επεξεργασία εκτός του κουτιού

Λύματα πλύσης και επώασης: Αντικαταστήστε ή συμπληρώστε τα συμβατικά λύματα πλύσης PBS με HEPES που περιέχουν διαλύματα-απόσβεση για τη μείωση των διακυμάνσεων του pH κατά τη διάρκεια του πλύματος, της χρωματισμού και άλλων σταδίων.

Πρέπει να σημειωθεί ότι αυτός ο τύπος εφαρμογής ακολουθεί την ίδια αρχή με την κυτταρική καλλιέργεια: το HEPES είναι συμπλήρωμα και όχι υποκατάστατο.Το αρχικό σύστημα νάτριο-βικαρβονίου στο βασικό μέσο καλλιέργειας πρέπει να διατηρείται., και τα δύο πρέπει να χρησιμοποιούνται σε συνδυασμό.

3Τρεις επιχειρησιακές προτάσεις για πειράματα σάρωσης

3.1 Σύντομη εφάπαξ έκθεση έξω από το κουτί. Προετοιμασία των αντιδραστηρίων για πλύση, στερέωση και διαπερατότητα με βήματα εκ των προτέρων, προθέρμανση στη θέση τους,και την ολοκλήρωση τους συνεχώς είναι πιο αποτελεσματική από την απλή αύξηση της συγκέντρωσης του αποθέτησηςΑυτό είναι το πιο εύκολο να παραβλεφθεί και εύκολα να βελτιωθεί.

3.2 Πρέπει να δίνεται προσοχή στο pH του διαλύματος πλύσης πριν από τη σταθεροποίηση.το pH θα αυξηθεί με την απόδραση του CO₂Η χρήση διαλύματος πλύσης που περιέχει HEPES μπορεί να κάνει αυτό το βήμα πιο ελεγχόμενο.

3.3 Αντιδραστήρες προθέρμανσης: Αντιδραστήρες χαμηλής θερμοκρασίας θα προκαλέσουν πρόσθετο σοκ θερμοκρασίας και, όταν συνδυάζονται με αλλαγές pH, θα προκαλέσουν μεγαλύτερη διαταραχή στα κύτταρα.Η συμβατική πρακτική είναι η εξισορρόπηση του απορρυπαντικού και του σταθεροποιητικού στην θερμοκρασία λειτουργίας εκ των προτέρων., αλλά το ίδιο το σταθεροποιητικό έχει ειδικές απαιτήσεις και πρέπει να ακολουθεί τις οδηγίες για την ειδική μέθοδο.

4Τέσσερις επιχειρησιακές προτάσεις για το πείραμα Transwell.

4.1 Η διαφορά του επιπέδου υγρού θα δημιουργήσει επιπλέον υδροστατική πίεση.που θα επηρεάσουν τα αποτελέσματα της μετανάστευσης· Επίσης δεν συμβάλλει στην ισορροπία του CO₂Συνιστάται οπτικός έλεγχος μετά την προσθήκη του υγρού.

4.2 Η διάρκεια επώασης για τα πειράματα μετανάστευσης/εισβολίας είναι συνήθως αρκετές ώρες έως δεκάδες ώρες.Εάν απαιτούνται πολλαπλές ενδιάμεσες παρατηρήσεις κατά την περίοδο αυτή, η χορήγηση συμπληρωμάτων HEPES μπορεί να μειώσει τις διακυμάνσεις του pH.

4.3  Τα βήματα δειγματοληψίας και χρωματισμού υποβάλλονται σε κεντρική επεξεργασία.Από το μικρό θάλαμο ολοκληρώνονται με κεντρικό και συνεχή τρόπο για να μειωθεί το ενδιάμεσο στάθμευση.

4.4  Η προσθήκη του HEPES θα αυξήσει την οσμωτική πίεση και τα περισσότερα κύτταρα θηλαστικών μπορούν να αντέξουν 260-350 mOsm/kg.Το πείραμα μετανάστευσης είναι ευαίσθητο στην οσμοτική κλίση πίεσης, και μετά την προσαρμογή του τύπου, το NaCl πρέπει να μετριέται και να προσαρμόζεται αναλόγως.

5Δύο κοινές σκέψεις

Το HEPES μπορεί να παράγει αντιδραστικά είδη οξυγόνου όπως υπεροξείδιο του υδρογόνου υπό ακτινοβολία ορατού φωτός,ειδικά στην παρουσία ριβοφλαβίνης στο περιβάλλον καλλιέργειαςΤα βήματα χρωματισμού και παρατήρησης συνοδεύονται συχνά από έκθεση στο φως και τα υγρά που περιέχουν HEPES πρέπει να φυλάσσονται μακριά από το φως.

Ο συντελεστής θερμοκρασίας pKa του HEPES είναι περίπου -0,014/°CΣυνιστάται η βαθμονόμηση του μετρητή pH υπό συνθήκες κοντά στην πραγματική θερμοκρασία λειτουργίας.

συσκευασία τύπου τύπου hepes

Οι μεταβλητές που εμπλέκονται στα πειράματα Crawling και Transwell είναι ήδη πολυάριθμες, με το pH να είναι το πιο εύκολο να παραβλεφθεί και εύκολα να βελτιωθεί.που επιτρέπει στα κύτταρα να εξακολουθούν να έχουν χωρητικότητα αποθήκευσης όταν βρίσκονται έξω από το κουτίΜε την αποτελεσματική εφαρμογή αυτών των δύο μέτρων, συνήθως παρατηρείται ορατή βελτίωση της συνέπειας των αποτελεσμάτων.

Η Hubei Xindesheng Material Technology Co., Ltd. έχει αφιερωθεί εδώ και καιρό στην έρευνα και την παραγωγήβιολογικά αποθηκευτικά παράγοντεςΤο HEPES και άλλα προϊόντα μπορούν να παρέχουν προμήθειες και εξατομικευμένους δείκτες από επίπεδα γραμμάτων έως τόνους.Η έδρα της εταιρείας βρίσκεται στην πόλη Guanggu United Science and Technology CityΗ εταιρεία διαθέτει δύο βάσεις έρευνας και ανάπτυξης και παραγωγής στο Gedian και το Huanggang (70 στρέμματα), με ετήσια παραγωγική ικανότητα 5000 τόνων για όλες τις κατηγορίες.Τα προϊόντα της χρησιμοποιούνται στην διαγνωστική IVD in vitro, τη βιοϊατρική και τις καθημερινές χημικές βιομηχανίες.