Application de l'HEPES dans les expériences de migration cellulaire et Transwell

L'exploration cellulaire et les expériences Transwell ont un problème commun: elles sont toutes deux des processus "multi-étapes, longue période", et les cellules et les échantillons doivent être traitées à plusieurs reprises dans un environnement non incubateur.La stabilité du pH dans de telles expériences a souvent un impact plus important sur les résultats que beaucoup ne le pensent..

1.Points douloureux communs de deux types d'expériences

Le procédé de montage des lames cellulaires comprend généralement: ensemencement sur un verre ou une lampe de couverture → culture à un état approprié → lavage → fixation → perméabilisation → coloration → scellement de la lampe.Le lavage.Les étapes de fixation et de coloration sont toutes effectuées sur un banc propre ou à température ambiante et les échantillons sont retirés à plusieurs reprises du CO.₂l'environnement.

Les expériences Transwell sont utilisées pour les études de migration, d'invasion et de co-culture: les cellules sont semées dans la chambre supérieure et le milieu de culture fournit des signaux chimiotaxiques à la chambre inférieure.Après un certain temps, la petite chambre est retirée, les cellules non migrantes de la chambre supérieure sont effacées, fixées pour la coloration et comptées.et il y a aussi plusieurs étapes d'échantillonnage et de traitement au milieu.

Le problème avec les deux est le même: chaque fois que vous quittez l'incubateur, le système tampon au bicarbonate tombe en panne brièvement.il peut entraîner une déviation de l'état cellulaire par rapport aux attentes.

épice 500 g

2.La place des HEPES dans ces processus

La capacité de tamponnage deHEPESne dépend pas du CO en phase gazeuse₂, avec un pKa d'environ 7,5 (25°C) et une plage de tamponnage efficace de 6,8 à 8.2La quantité d'addition générale indiquée dans les données techniques du fabricant est de 10 à 25 mM.

Dans les procédés de ramassage et de transwell, il est principalement utilisé à deux endroits:

Médium de culture et fluide d'exploitation: Supplément HEPES dans le système de culture pour maintenir les cellules dans un environnement à pH stable lorsqu'elles sont traitées en dehors de la boîte

Solutions de lavage et d'incubation: remplacer ou compléter les solutions de lavage PBS classiques par des solutions tampons contenant du HEPES afin de réduire les fluctuations du pH lors du lavage, de la coloration et d'autres étapes

Il convient de noter que ce type d'application suit le même principe que la culture cellulaire: le HEPES est un complément et non un substitut.Le système de bicarbonate de sodium d'origine dans le milieu de culture de base doit être conservé., et les deux doivent être utilisés en association.

3Trois suggestions opérationnelles pour les expériences de rampage

3.1 Réduire l'exposition unique en dehors de la boîte. Préparer les réactifs pour le lavage, la fixation et la perméabilisation, les préchauffer en place,et les compléter en continu est plus efficace que d' augmenter simplement la concentration du tamponC'est le plus facilement négligé et facilement amélioré.

3.2 Faites attention au pH de la solution de lavage avant la fixation. Si un liquide sans capacité tampon est utilisé pour le lavage avant la fixation, ou si le liquide est laissé dans l'air trop longtemps,le pH va augmenter avec l'échappement de CO₂L'utilisation d'une solution de lavage tampon contenant du HEPES peut rendre cette étape plus contrôlable.

3.3 Réactifs de préchauffage: les réactifs à basse température provoqueront un choc de température supplémentaire et, lorsqu'ils sont combinés à des changements de pH, ils perturberont davantage les cellules.La pratique habituelle consiste à équilibrer le détergent et le fixant à la température de fonctionnement à l'avance, mais le fixant lui-même a des exigences spécifiques et doit suivre les instructions de la méthode spécifique.

4Quatre suggestions opérationnelles pour l'expérience Transwell

4.1 Gardez les niveaux de liquide dans les chambres supérieure et inférieure constants, c'est l'exigence de base pour les expériences Transwell.qui affecteront les résultats de la migrationIl n'est pas non plus propice à l'équilibre du CO₂Il est recommandé de vérifier visuellement après ajout du liquide.

4.2 La durée d'incubation des expériences de migration/invasion est généralement de plusieurs heures à plusieurs dizaines d'heures.Si plusieurs observations à mi-parcours sont requises au cours de cette période, la supplémentation en HEPES peut réduire les fluctuations du pH.

4.3  Les étapes d'échantillonnage et de teinture sont traitées de manière centralisée, de même que les étapes de retrait, d'effacement, de fixation, de teinture, etc.Les travaux de la petite chambre sont réalisés de manière centralisée et continue afin de réduire le stationnement intermédiaire..

4.4  L'ajout de HEPES augmentera la pression osmotique, et la plupart des cellules de mammifères peuvent tolérer 260 à 350 mOsm/kg.L'expérience de migration est sensible au gradient de pression osmotique, et après ajustement de la formule, le NaCl doit être mesuré et ajusté en conséquence.

5Deux considérations communes

Évitez la lumière tout au long du processus. Le HEPES peut générer des espèces réactives d'oxygène telles que le peroxyde d'hydrogène sous irradiation par la lumière visible,en particulier en présence de riboflavine dans le milieu de cultureLes étapes de coloration et d'observation sont souvent accompagnées d'une exposition à la lumière et les liquides contenant du HEPES doivent être conservés à l'abri de la lumière.

Le coefficient de température pKa du HEPES est d'environ -0,014/°CIl est recommandé de calibrer le pH-mètre dans des conditions proches de la température de fonctionnement réelle.

emballage de tambour hepes

Les variables impliquées dans les expériences de rampage et de Transwell sont déjà nombreuses, le pH étant le plus facilement négligé et facilement amélioré.permettant aux cellules d'avoir toujours une capacité de tamponnage en dehors de la boîteEn appliquant efficacement ces deux mesures, on obtient généralement une amélioration visible de la cohérence des résultats.

Hubei Xindesheng Material Technology Co., Ltd. s'est depuis longtemps consacrée à la recherche et à la production deagents de tamponnage biologiquesLes HEPES et d'autres produits peuvent fournir des indicateurs d'approvisionnement et personnalisés, de gramme à tonne.Le siège social de la société est situé à Guanggu United Science and Technology City.Elle possède deux bases de R&D et de production à Gedian et Huanggang (70 acres), avec une capacité de production annuelle de 5000 tonnes pour toutes les catégories.Ses produits sont utilisés dans le diagnostic in vitro de la DIV, la biomédecine et les industries chimiques quotidiennes.