세포 이동 및 트랜스웰 실험에서의 HEPES 적용

세포 탐색과 트랜스웰 실험은 공통적인 문제점이 있습니다. 둘 다 "다단계, 긴 기간" 과정이며, 세포와 샘플은 인큐베이터 환경이 아닌 환경에서 반복적으로 처리되어야 합니다.그러한 실험 에서 pH 의 안정성 은 종종 많은 사람 들 이 예상 하는 것 보다 더 큰 영향 을 미칩니다.

1두 종류의 실험의 일반적인 고통점

세포 슬라이드 장착 과정은 일반적으로: 덮개 유리 또는 슬라이드에 심기 → 적절한 상태로 키움 → 씻기 → 고정 → 투명화 → 염색 → 슬라이드를 밀폐합니다.세탁, 고정 및 염색 단계 모두 깨끗한 벤치 또는 방 온도에서 완료되고 샘플은 반복적으로 CO에서 제거됩니다.₂환경

트랜스웰 실험은 이주, 침략 및 공동 배양 연구를 위해 사용됩니다. 세포는 상층 챔버에 심어지고, 배양 매체는 하층 챔버에 화학적 신호를 제공합니다.일정 기간 후에작은 방이 제거되고, 상층 방의 이동하지 않는 세포는 지워지고, 염색을 위해 고정되어 계산됩니다. 전체 과정의 잠복 기간은 길습니다.그리고 중간에 여러 샘플링과 처리 단계가 있습니다..

이 두 가지의 문제는 동일합니다. 인큐베이터를 떠날 때마다 바이카보네이트 버퍼 시스템이 잠시 고장납니다. 짧은 단계의 영향은 제한적입니다.세포 상태가 예상치와는 다른 상태로 나타날 수 있습니다..

500g

2이러한 과정에서의 HEPES의 위치

펌퍼 용량HEPES가스상 CO에 의존하지 않습니다.₂약 7. 5 (25°C그리고 6.8~8의 효과적 버퍼 범위입니다.2, 이는 포유류 세포의 성장 범위와 일치합니다. 제조업체의 기술 데이터에 표시된 일반적인 추가 양은 10-25mM입니다.

크롤링과 트랜스웰 과정에서 주로 두 곳에서 사용됩니다.

배양 매체와 작동 액체: 배양 시스템에서 HEPES를 보충하여 상자 밖에서 처리 할 때 세포를 안정적인 pH 환경에서 유지합니다.

세척 및 잠복 용액: 세척, 염색 및 다른 단계 중 pH 변동을 줄이기 위해 기존 PBS 세척 용액을 HEPES를 포함하는 완충 용액으로 대체하거나 보충하십시오.

이 유형의 적용은 세포 배양과 동일한 원칙을 따르고 있다는 점에 유의해야합니다: HEPES는 보충제이며 대체물이 아닙니다.기본 배양 매체에서 원래의 나트륨 바이카보네트 시스템은 유지되어야 합니다.이 두 가지는 함께 사용해야합니다.

3크래핑 실험에 대한 3가지 운영 제안

3.1 상자 밖에서의 단발 노출을 단축한다. 세척, 고정 및 투명화 단계에 대한 반응 물질을 미리 준비하고,그리고 지속적으로 완료하는 것은 단순히 버퍼 농도를 증가하는 것보다 더 효과적입니다.이것은 가장 쉽게 간과되고 쉽게 개선되는 것입니다.

3.2 고정하기 전에 세척 용액의 pH에 주의를 기울여야 한다. 고정하기 전에 세척에 완충 용량이 없는 액체를 사용하거나 액체를 너무 오랫동안 공기 중에 남겨두면이산화탄소 배출에 따라 pH가 상승합니다.₂HEPES를 포함하는 버퍼 세척 용액을 사용하면이 단계를 더 제어 할 수 있습니다.

3.3 전열 반응기: 낮은 온도 반응기는 추가 온도 충격을 가져오고 pH 변화와 결합하면 세포에 더 큰 혼란을 일으킬 것입니다.일반적인 관행은 미리 작업 온도에 세척제와 고정제를 균형입니다., 그러나 고정제 자체는 특정 요구 사항이 있으며 특정 방법 지침을 따라야합니다.

4트랜스웰 실험에 대한 4가지 운영 제안

4.1 상부와 하부 방의 액체 수치를 일정하게 유지합니다. 이것은 트랜스웰 실험의 기본 요구 사항입니다. 액체 수준의 차이는 추가적인 수압을 형성합니다.마이그레이션 결과에 영향을 줄또한 이산화탄소 균형에도 도움이 되지 않습니다.₂상위 방과 하위 방 사이의 pH. 액체를 추가 한 후 시각적으로 확인하는 것이 좋습니다.

4.2 긴 잠복 기간 동안 버퍼 용량에주의를 기울여야 합니다. 이주/침략 실험의 잠복 시간은 일반적으로 몇 시간에서 수십 시간입니다.이 기간 동안 여러 중간 관찰이 필요한 경우, HEPES 보충제는 pH 변동을 줄일 수 있습니다.

4.3  샘플링 및 염색 단계는 중앙 처리됩니다. 크롤링과 마찬가지로 제거, 지우기, 고정, 염색 등을 처리합니다.중간에 주차를 줄이기 위해 중앙 집중식 및 연속적인 방식으로 완료됩니다.

4.4  오스모틱 압력을 검토합니다. HEPES를 추가하면 오스모틱 압력이 증가하고 대부분의 포유류 세포는 260-350 mOsm/kg을 견딜 수 있습니다.이동 실험은 오스모틱 압력 경사에 민감합니다.수식을 조정한 후 NaCl을 측정하고 그에 따라 조정해야 합니다.

5두 가지 일반적인 고려 사항

전체 과정 동안 빛을 피하십시오. HEPES는 가시광선 방사선 하에서 과산화수소와 같은 반응성 산소 종을 생성 할 수 있습니다.특히 배양 매체에 리보플라빈이 존재할 때염색 및 관찰 단계는 종종 빛에 노출되어 있으며 HEPES를 포함하는 액체는 빛으로부터 멀리 보관되어야합니다.

PH는 작동 온도에서 정렬됩니다. HEPES의 pKa 온도 계수는 대략 -0.014/입니다.°C실제 작동 온도에 가까운 조건에서 pH 미터를 캘리브레이션하는 것이 좋습니다.

헤프스 드럼 포장

크롤링과 트랜스웰 실험에 관련된 변수는 이미 많으며, pH는 가장 쉽게 간과되고 쉽게 개선되는 변수입니다.박스 바깥에 있는 세포가 여전히 버퍼 기능을 유지할 수 있도록이 두 가지 조치를 효과적으로 실행하면 일반적으로 결과의 일관성이 눈에 띄게 향상됩니다.

후베이 신데?? 재료 기술 회사, Ltd는 오랫동안 연구와 생산에 헌신했습니다생물학적 완충제HEPES 및 다른 제품은 그램에서 톤 수준까지 공급 및 맞춤 표시기를 제공 할 수 있습니다.회사의 본사는 광구 연합 과학 기술 도시에 위치하고 있습니다., 에즈우, 후베이 지방의 게디안 개발 구역. 게디안과 후안강 (70 에이커) 에 두 개의 연구 개발 및 생산 기지를 보유하고 있으며, 모든 범주의 연간 생산 용량이 5000 톤입니다.그 제품은 비트로 진단의 IVD에서 사용됩니다., 생의학, 그리고 일상 화학 산업.