Applicazione di HEPES negli esperimenti di crawling cellulare e di transwell

Gli esperimenti di scansione cellulare e Transwell hanno un problema comune: sono entrambi processi "a più fasi, a lungo termine" e le cellule e i campioni devono essere elaborati ripetutamente in un ambiente non incubatore. La stabilità del pH in tali esperimenti spesso ha un impatto maggiore sui risultati di quanto molte persone si aspettano.

1. Punti critici comuni di due tipi di esperimenti

Il processo di montaggio del vetrino cellulare solitamente comprende: semina su un vetrino o vetrino → coltura fino a uno stato appropriato → lavaggio → fissazione → permeabilizzazione → colorazione → sigillatura del vetrino. Le fasi di lavaggio, fissazione e colorazione vengono tutte completate su un banco pulito o a temperatura ambiente e i campioni vengono rimossi ripetutamente dalla CO₂ambiente.

Gli esperimenti Transwell vengono utilizzati per studi di migrazione, invasione e cocoltura: le cellule vengono seminate nella camera superiore e il mezzo di coltura fornisce segnali chemiotattici alla camera inferiore. Dopo un certo periodo di tempo, la camera piccola viene rimossa, le cellule non migranti nella camera superiore vengono cancellate, fissate per la colorazione e contate. Il periodo di incubazione dell'intero processo è lungo e nel mezzo sono presenti anche più fasi di campionamento e lavorazione.

Il problema con entrambi è lo stesso: ogni volta che si lascia l'incubatrice, il sistema tampone di bicarbonato si guasta brevemente. L'impatto sui passi brevi è limitato, ma se accumulato può far sì che lo stato della cella si discosti dalle aspettative.

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2.La posizione di HEPES in tali processi

La capacità tampone diHEPESnon dipende dalla CO in fase gassosa₂, con un pKa di circa 7,5 (25℃) e un intervallo di buffering efficace di 6,8-8,2, che coincide con l'intervallo di crescita delle cellule di mammifero. La quantità generale di aggiunta indicata nei dati tecnici del produttore è di 10-25 mM.

Nei processi di scansione e Transwell viene utilizzato principalmente in due punti:

Terreno di coltura e fluido operativo: integrare HEPES nel sistema di coltura per mantenere le cellule in un ambiente a pH stabile quando vengono processate fuori dagli schemi

Soluzioni di lavaggio e incubazione: sostituire o integrare le soluzioni di lavaggio PBS convenzionali con soluzioni tampone contenenti HEPES per ridurre le fluttuazioni del pH durante il lavaggio, la colorazione e altre fasi

Va notato che questo tipo di applicazione segue lo stesso principio della coltura cellulare: HEPES è un supplemento, non un sostituto. Il sistema originale di bicarbonato di sodio nel terreno di coltura di base dovrebbe essere mantenuto e i due dovrebbero essere usati in combinazione.

3.Tre suggerimenti operativi per esperimenti di scansione

3.1 Accorciare la singola esposizione fuori dagli schemi. Preparare in anticipo i reagenti per le fasi di lavaggio, fissazione e permeabilizzazione, preriscaldarli sul posto e completarli continuamente è più efficace del semplice aumento della concentrazione del tampone. Questo è quello più facilmente trascurato e facilmente migliorabile.

3.2 Prestare attenzione al pH della soluzione di lavaggio prima della fissazione. Se si utilizza un liquido senza capacità tampone per il lavaggio prima della fissazione o se il liquido viene lasciato nell'aria per troppo tempo, il pH aumenterà con la fuoriuscita di CO₂. L'utilizzo di una soluzione di lavaggio tampone contenente HEPES può rendere questo passaggio più controllabile.

3.3 Preriscaldamento dei reagenti. I reagenti a bassa temperatura apporteranno un ulteriore shock termico e, se combinati con i cambiamenti del pH, causeranno maggiori disturbi alle cellule. La pratica convenzionale consiste nel bilanciare in anticipo il detergente e il fissativo con la temperatura operativa, ma il fissativo stesso ha requisiti specifici e deve seguire le istruzioni specifiche del metodo.

4.Quattro suggerimenti operativi per l'esperimento Transwell

4.1 Mantenere costanti i livelli del liquido nelle camere superiore e inferiore. Questo è il requisito di base per gli esperimenti Transwell. La differenza di livello del liquido formerà un'ulteriore pressione idrostatica, che influenzerà i risultati della migrazione; Inoltre non è favorevole al bilancio della CO₂e pH tra le camere superiore e inferiore. Si consiglia di controllare visivamente dopo aver aggiunto il liquido.

4.2 Prestare attenzione alla capacità tampone durante il lungo periodo di incubazione. Il tempo di incubazione per gli esperimenti di migrazione/invasione varia solitamente da diverse ore a decine di ore. Se durante questo periodo sono necessarie più osservazioni a medio termine, l’integrazione di HEPES può ridurre le fluttuazioni del pH.

4.3  Le fasi di campionamento e colorazione vengono elaborate centralmente. Similmente al gattonare, le fasi di rimozione, cancellazione, fissaggio, colorazione, ecc. dalla cameretta vengono completate in modo centralizzato e continuo per ridurre i parcheggi intermedi.

4.4  Controllare la pressione osmotica. L'aggiunta di HEPES aumenterà la pressione osmotica e la maggior parte delle cellule di mammifero può tollerare 260-350 mOsm/kg. L'esperimento di migrazione è sensibile al gradiente di pressione osmotica e, dopo aver regolato la formula, NaCl deve essere misurato e regolato di conseguenza.

5.Due considerazioni comuni

Evitare la luce durante l'intero processo. HEPES può generare specie reattive dell'ossigeno come il perossido di idrogeno sotto irradiazione di luce visibile, specialmente in presenza di riboflavina nel mezzo di coltura. Le fasi di colorazione e osservazione sono spesso accompagnate da un'esposizione alla luce e i liquidi contenenti HEPES devono essere conservati al riparo dalla luce

Il PH è calibrato alla temperatura di esercizio. Il coefficiente di temperatura pKa di HEPES è circa -0,014/℃. Si consiglia di calibrare il pHmetro in condizioni prossime alla temperatura operativa effettiva

Hepes imballaggio del tamburo

Le variabili coinvolte negli esperimenti di scansione e Transwell sono già numerose, e il pH è quello più facilmente trascurato e facilmente migliorabile. Esistono solo due approcci fondamentali: consentire alle celle di avere ancora capacità tampone quando sono fuori dagli schemi e comprimere i passaggi fuori dagli schemi alla minore lunghezza possibile. Implementando queste due misure in modo efficace, di solito si ottiene un miglioramento visibile nella coerenza dei risultati.

Hubei Xindesheng Material Technology Co., Ltd. è da tempo dedicata alla ricerca e alla produzione diagenti tamponanti biologicie relativi prodotti chimici fini. HEPES e altri prodotti possono fornire indicatori di fornitura e personalizzati da livelli di grammi a tonnellate. La sede centrale dell'azienda si trova a Guanggu United Science and Technology City, Gedian Development Zone, Ezhou, provincia di Hubei. Ha due basi di ricerca e sviluppo e produzione a Gedian e Huanggang (70 acri), con una capacità di produzione annua di 5.000 tonnellate per tutte le categorie. I suoi prodotti sono utilizzati nella diagnostica in vitro IVD, nella biomedicina e nell'industria chimica quotidiana.