Anwendung von HEPES in Zellkriech- und Transwell-Experimenten

Zell-Crawling und Transwell-Experimente haben ein gemeinsames Problem: Beide sind "mehrstufige, langfristige" Prozesse, und Zellen und Proben müssen in einer nicht-Inkubatorumgebung wiederholt verarbeitet werden.Die Stabilität des pH-Wertes in solchen Experimenten beeinflusst die Ergebnisse oft stärker, als viele Menschen erwarten..

1Gemeinsame Schmerzpunkte bei zwei Versuchsarten

Der Prozess der Montage von Zellträgern umfasst in der Regel: Einpflanzung auf ein Abdeckglas oder eine Trittscheibe → Kultivierung bis zu einem geeigneten Zustand → Waschen → Fixierung → Permeabilierung → Färbung → Versiegelung der Trittscheibe.Die Wäsche., Fixierung und Färbung alle Schritte auf einer sauberen Bank oder bei Raumtemperatur abgeschlossen und die Proben wiederholt aus dem CO entfernt werden₂Umwelt.

Transwell-Experimente werden für Migrations-, Invasion- und Co-Kulturstudien verwendet: Zellen werden in der oberen Kammer gesät, und das Kulturmedium liefert chemotaxische Signale an die untere Kammer.Nach einer gewissen Zeit, wird die kleine Kammer entfernt, die nicht wandernde Zellen in der oberen Kammer gelöscht, zur Färbung befestigt und gezählt.und es gibt auch mehrere Probenahme und Verarbeitung Schritte in der Mitte.

Das Problem bei beiden ist dasselbe: Jedes Mal, wenn man den Brutkasten verlässt, versagt das Bicarbonat-Puffersystem kurzzeitig.es kann dazu führen, dass der Zellzustand von den Erwartungen abweicht.

Hepes 500 g

2Die Position von HEPES in solchen Prozessen

Die Pufferkapazität vonHEPESist nicht abhängig von Gasphasen-CO₂, mit einem pKa von ca. 7,5 (25°C) und einen effektiven Pufferbereich von 6,8 bis 8.2Die in den technischen Daten des Herstellers angegebene allgemeine Zusatzmenge beträgt 10-25 mM.

In den Prozessen des Krabbens und Transwell wird es hauptsächlich an zwei Stellen verwendet:

Kulturmedium und Betriebsflüssigkeit: Ergänzung HEPES im Kultursystem, um die Zellen bei der Verarbeitung außerhalb der Box in einer stabilen pH-Umgebung zu halten

Wasch- und Inkubationslösungen: Ersetzen oder ergänzen Sie herkömmliche PBS-Waschlösungen durch HEPES-haltige Pufferlösungen, um pH-Schwankungen während des Waschens, der Färbung und anderer Schritte zu reduzieren.

Es ist zu beachten, dass bei dieser Art der Anwendung das gleiche Prinzip wie bei der Zellkultur gilt: HEPES ist eine Ergänzung, kein Ersatz.Das ursprüngliche Natriumbicarbonat-System sollte im Grundkulturmedium erhalten bleiben., und beide sollten in Kombination angewendet werden.

3.Drei operationelle Vorschläge für Crawling-Experimente

3.1 Verkürzung der Einmalbelastung außerhalb der Verpackung; Vorbereitung der Reagenzien zum Waschen, Fixieren und Permeabilizen und Vorwärmen vor Ort;und sie kontinuierlich zu vervollständigen, ist effektiver als einfach die Pufferkonzentration zu erhöhen.Dies ist die am leichtesten übersehen und am leichtesten zu verbessern.

3.2 Vor der Fixierung ist auf den pH-Wert der Waschlösung zu achten. Wird vor der Fixierung eine Flüssigkeit ohne Pufferfähigkeit zum Waschen verwendet oder bleibt die Flüssigkeit zu lange in der Luft,Der pH-Wert steigt mit dem CO-Ausstoß.₂Die Verwendung einer HEPES-haltigen Pufferwaschlösung kann diesen Schritt besser kontrollieren.

3.3 Vorwärmreagenzien: Niedrige Temperaturreagenzien führen zu zusätzlichem Temperaturschlag und verursachen in Kombination mit pH-Veränderungen größere Störungen der Zellen.Die übliche Praxis besteht darin, das Reinigungsmittel und das Fixierungsmittel im Voraus an die Betriebstemperatur auszugleichen., aber das Fixierungsmittel selbst hat spezifische Anforderungen und sollte den spezifischen Methodenanweisungen entsprechen.

4Vier operationelle Vorschläge für das Transwell-Experiment

4.1 Die Differenz zwischen den Flüssigkeitswerten in den oberen und unteren Kammern ist die Grundvoraussetzung für Transwell-Experimente.die sich auf die Ergebnisse der Migration auswirkenEs ist auch nicht förderlich für die CO-Bilanz.₂Es wird empfohlen, nach dem Hinzufügen der Flüssigkeit visuell zu überprüfen.

4.2 Beachten Sie die Pufferkapazität während der langen Inkubationszeit.Wenn mehrere Halbzeitbeobachtungen während dieses Zeitraums erforderlich sind, kann die Ergänzung mit HEPES die pH-Schwankungen reduzieren.

4.3  Die Probenahme- und Färbungsschritte werden zentral verarbeitet, ähnlich wie beim Krabbeln werden die Schritte Entfernen, Löschen, Fixieren, Färben usw. durchgeführt.Die Anlagen aus der kleinen Kammer werden in zentraler und kontinuierlicher Weise fertiggestellt, um das Zwischenparken zu reduzieren..

4.4  Der Zusatz von HEPES erhöht den Osmosedruck, und die meisten Säugetierzellen können 260-350 mOsm/kg vertragen.Das Migrations-Experiment ist empfindlich auf den osmotischen Druckgradienten., und nach Anpassung der Formel sollte NaCl gemessen und entsprechend angepasst werden.

5.Zwei allgemeine Erwägungen

HEPES kann unter sichtbarer Lichtbestrahlung reaktive Sauerstoffspezies wie Wasserstoffperoxid erzeugen.vor allem in Gegenwart von Riboflavin im KulturmediumDie Farb- und Beobachtungsschritte werden häufig durch Lichtbelastung begleitet, und Flüssigkeiten, die HEPES enthalten, sollten fern von Licht gelagert werden.

Der pH-Wert wird bei der Betriebstemperatur kalibriert. Der pKa-Temperaturkoeffizient von HEPES beträgt etwa -0,014/°CEs wird empfohlen, den pH-Meter unter Bedingungen zu kalibrieren, die der tatsächlichen Betriebstemperatur nahe liegen.

Hepes-Trommelverpackungen

Die Variablen, die in den Crawling- und Transwell-Experimenten beteiligt sind, sind bereits zahlreich, wobei der pH-Wert am leichtesten übersehen und leicht verbessert wird.so dass Zellen auch außerhalb der Box eine Pufferkapazität habenDurch die wirksame Durchführung dieser beiden Maßnahmen wird in der Regel eine sichtbare Verbesserung der Konsistenz der Ergebnisse erzielt.

Hubei Xindesheng Material Technology Co., Ltd. widmet sich seit langem der Forschung und Produktion vonbiologische PuffermittelHEPES und andere Produkte können Lieferungs- und individuell angepasste Indikatoren von Gramm bis Tonnen liefern.Der Hauptsitz des Unternehmens befindet sich in der Guanggu United Science and Technology City, Gedian Development Zone, Ezhou, Provinz Hubei. Es verfügt über zwei FuE- und Produktionsbasen in Gedian und Huanggang (70 Hektar), mit einer jährlichen Produktionskapazität von 5000 Tonnen für alle Kategorien.Seine Produkte werden in der In-vitro-Diagnostik verwendet., Biomedizin und der täglichen chemischen Industrie.