Применение HEPES в экспериментах по ползанию клеток и трансвелль

У экспериментов сканирования клеток и Transwell есть общая проблема: оба они представляют собой «многоэтапные, длительные» процессы, и клетки и образцы необходимо многократно обрабатывать в неинкубаторной среде. Стабильность pH в таких экспериментах часто оказывает большее влияние на результаты, чем многие ожидают.

1.Общие болевые точки двух типов экспериментов

Процесс крепления предметного стекла обычно включает в себя: посев на покровное стекло или предметное стекло → культивирование до соответствующего состояния → промывание → фиксацию → пермеабилизацию → окрашивание → запечатывание предметного стекла. Этапы промывки, фиксации и окрашивания выполняются на чистом столе или при комнатной температуре, а образцы неоднократно извлекаются из CO.₂среда.

Эксперименты Transwell используются для исследований миграции, инвазии и совместной культуры: клетки высевают в верхнюю камеру, а культуральная среда передает хемотаксические сигналы в нижнюю камеру. Через определенный промежуток времени малую камеру удаляют, немигрирующие клетки верхней камеры стирают, фиксируют для окраски и подсчитывают. Инкубационный период всего процесса длительный, и в середине его также есть несколько этапов отбора проб и обработки.

Проблема в обоих случаях одна и та же: каждый раз, когда вы выходите из инкубатора, бикарбонатная буферная система ненадолго выходит из строя. Влияние на короткие шаги ограничено, но при накоплении оно может привести к отклонению состояния клетки от ожиданий.

гепес 500г

2.Позиция HEPES в таких процессах

Буферная емкостьХЕПЕСне зависит от газовой фазы CO₂, с pKa примерно 7,5 (25℃) и эффективный диапазон буферности 6,8-8,2, который совпадает с диапазоном роста клеток млекопитающих. Общее количество добавки, указанное в технических данных производителя, составляет 10-25 мМ.

В процессах сканирования и Transwell он в основном используется в двух местах:

Культуральная среда и рабочая жидкость: добавьте HEPES в культуральную систему, чтобы поддерживать стабильный pH среды при обработке клеток вне коробки.

Растворы для промывки и инкубации: замените или дополните обычные промывочные растворы PBS буферными растворами, содержащими HEPES, чтобы уменьшить колебания pH во время промывки, окрашивания и других этапов.

Следует отметить, что этот тип применения основан на том же принципе, что и клеточная культура: HEPES является добавкой, а не заменой. Исходную систему бикарбоната натрия в основной культуральной среде следует сохранить и использовать в сочетании.

3.Три практических предложения по экспериментам со сканированием

3.1 Сократите одиночную экспозицию нестандартно. Предварительная подготовка реагентов для этапов промывки, фиксации и пермеабилизации, предварительное их нагревание на месте и непрерывное их выполнение более эффективны, чем простое увеличение концентрации буфера. Это наиболее легко упускаемый из виду и легко улучшаемый вариант.

3.2 Перед фиксацией обратите внимание на pH промывного раствора. Если для промывки перед фиксацией используется жидкость без буферной способности или если жидкость остается на воздухе слишком долго, pH повысится с выделением CO.₂. Использование буферного промывочного раствора, содержащего HEPES, может сделать этот этап более контролируемым.

3.3 Предварительный подогрев реагентов. Низкотемпературные реагенты вызовут дополнительный температурный шок, а в сочетании с изменениями pH они вызовут большее нарушение клеток. Обычной практикой является заранее сбалансировать моющее средство и фиксатор до рабочей температуры, но к самому фиксатору предъявляются особые требования, и он должен соответствовать конкретным инструкциям по методу.

4.Четыре оперативных предложения по эксперименту Transwell

4.1 Поддерживайте одинаковый уровень жидкости в верхней и нижней камерах. Это основное требование для экспериментов Трансвелла. Перепад уровней жидкости создаст дополнительное гидростатическое давление, что повлияет на результаты миграции; Это также не способствует балансу CO.₂и pH между верхней и нижней камерами. Рекомендуется визуально проверить после добавления жидкости.

4.2 Обратите внимание на буферную емкость в течение длительного инкубационного периода. Инкубационный период экспериментов по миграции/инвазии обычно составляет от нескольких часов до десятков часов. Если в течение этого периода требуются многочисленные промежуточные наблюдения, добавление HEPES может уменьшить колебания pH.

4.3  Этапы отбора проб и окрашивания выполняются централизованно. Подобно ползанию, этапы удаления, стирания, фиксации, окрашивания и т. д. из небольшой камеры выполняются централизованно и непрерывно, чтобы уменьшить промежуточную парковку.

4.4  Проверьте осмотическое давление. Добавление HEPES увеличит осмотическое давление, и большинство клеток млекопитающих могут переносить 260-350 мОсм/кг. Эксперимент по миграции чувствителен к градиенту осмотического давления, и после корректировки формулы необходимо измерить и соответствующим образом отрегулировать NaCl.

5. Два общих соображения

Избегайте света на протяжении всего процесса. HEPES может генерировать активные формы кислорода, такие как перекись водорода, под воздействием видимого света, особенно в присутствии рибофлавина в культуральной среде. Этапы окрашивания и наблюдения часто сопровождаются воздействием света, поэтому жидкости, содержащие HEPES, следует хранить в защищенном от света месте.

PH калибруется при рабочей температуре. Температурный коэффициент pKa HEPES составляет примерно -0,014/℃. Рекомендуется калибровать pH-метр в условиях, близких к фактической рабочей температуре.

барабанная упаковка Hepes

Переменные, задействованные в экспериментах по сканированию и Transwell, уже многочисленны, причем pH является наиболее легко упускаемым из виду и легко улучшаемым. Существует только два основных подхода: позволить ячейкам сохранять буферную емкость, когда они находятся за пределами поля, и сжать шаги вне поля до минимально возможной длины. Эффективное применение этих двух мер обычно приводит к заметному улучшению последовательности результатов.

Компания Hubei Xindesheng Material Technology Co., Ltd. уже давно занимается исследованиями и производствомбиологические буферные агентыи связанные с ними тонкие химикаты. HEPES и другие продукты могут обеспечить поставки и индивидуальные показатели от грамма до тонны. Штаб-квартира компании расположена в Объединенном научно-технологическом городе Гуангу, зона развития Гэдиан, Эчжоу, провинция Хубэй. Компания имеет две научно-исследовательские и производственные базы в Гэдиане и Хуангане (70 акров) с годовой производственной мощностью 5000 тонн для всех категорий. Ее продукция используется в диагностике in vitro, биомедицине и повседневной химической промышленности.