Por que a solução de Tris fica amarela depois de ser deixada por muito tempo?

No laboratório, é comum encontrar situações em que um frasco de solução tampão Tris pré-preparada, após ser armazenada por um período de tempo, muda de uma solução incolor e transparente para uma cor amarelo claro ou até mesmo marrom claro. Muitos experimentadores podem hesitar se tal solução ainda pode ser usada. Este artigo analisa as razões para a descoloração da solução de Tris e o impacto de diferentes níveis de cor no experimento.

A razão fundamental para a descoloração da solução de Tris

O amarelamento da solução de Tris após o armazenamento não se deve a nenhuma alteração na própria molécula de Tris. O Tris (trihidroximetilaminometano) possui uma estrutura química relativamente estável e não se decompõe nem descolore por si só em condições convencionais de armazenamento. A verdadeira razão para a descoloração está relacionada a impurezas na solução. O Tris pode conter vestígios de impurezas orgânicas de aldeído ou amina durante o processo de produção. Quando essas impurezas entram em contato com íons metálicos e oxigênio dissolvido na solução, elas sofrem reações lentas de oxidação e condensação, gerando substâncias coloridas com estruturas conjugadas. Íons de metais de transição como ferro, cobre e manganês desempenham um papel catalítico nisso. Além disso, o teor de íons metálicos na água usada para a preparação também pode afetar a velocidade e o grau de mudança de cor. Soluções preparadas com água deionizada ou água destilada apresentam uma taxa de mudança de cor ligeiramente mais rápida do que a água ultrapura. A luz e a temperatura são fatores promotores, e a luz solar direta ou ambientes de alta temperatura podem acelerar a reação de oxidação.

(Matéria-prima Tris 25kg/tambor)

O tampão Tris que muda de cor ainda pode ser usado

A resposta a esta pergunta depende do grau de descoloração da solução e do cenário de uso. Se a solução apenas ficar levemente amarelada e parecer muito pálida, ela ainda pode ser usada em circunstâncias normais. Como a capacidade tampão do Tris não é afetada, o valor de pH da solução permanece relativamente estável e o teor de impurezas coloridas é muito baixo, o que não causará interferência observável na maioria dos experimentos convencionais. Para experimentos rotineiros como eletroforese de proteínas, eletroforese de ácidos nucleicos e Western blot, o tampão Tris com leve descoloração não afetará significativamente os resultados experimentais. Mas se a cor da solução escurecer visivelmente, aparecendo amarelo escuro ou marrom, indica que uma certa quantidade de produtos de oxidação se acumulou na solução, e recomenda-se não usá-la mais. Essas substâncias coloridas podem aumentar a coloração de fundo durante a eletroforese, causar interferência de absorbância na detecção espectrofotométrica e podem afetar o estado celular em certos experimentos com células.

Como determinar se uma solução de Tris que muda de cor é utilizável

O laboratório pode fazer um julgamento simples com base no tipo real de experimento. Para situações em que é usado apenas como tampão de eletroforese, pegue uma pequena quantidade de solução que muda de cor e realize um teste para observar se há diferenças significativas na clareza das bandas e na cor de fundo em comparação com o tampão recém-preparado. Para purificação de proteínas ou análise cromatográfica, recomenda-se cautela, pois impurezas coloridas podem adsorver na coluna cromatográfica e afetar a eficiência da separação. Para meios de cultura celular, soluções que mudam de cor não são recomendadas, pois produtos de oxidação podem ter efeitos adversos no crescimento celular. O princípio geral é que quanto mais escura a cor e quanto maiores os requisitos experimentais, mais ela deve ser reconfigurada. Se aparecer sedimento ou turbidez na solução, isso indica contaminação severa e deve ser descartada independentemente da cor.

Como prevenir a descoloração da solução de Tris

Prevenir a descoloração é mais eficaz do que determinar se ela pode ser usada. Ao preparar o tampão Tris, o uso de água ultrapura recém-preparada pode reduzir o teor de íons metálicos e matéria orgânica na água. Após a preparação, a solução é submetida à esterilização por alta pressão a 121 graus Celsius por 20 minutos. O processo de esterilização pode remover parte do oxigênio dissolvido e microrganismos, o que ajuda a retardar as reações de oxidação durante o armazenamento subsequente. A solução esterilizada deve ser armazenada em um recipiente selado, evitando luz e altas temperaturas. Se for necessário armazenamento a longo prazo, a solução pode ser dividida em frascos pequenos e retirada um frasco de cada vez para reduzir a chance de abrir a tampa repetidamente e introduzir oxigênio e poluentes. O armazenamento refrigerado também pode reduzir efetivamente a taxa de reações químicas, mas a solução após refrigeração precisa ser reaquecida e o pH reavaliado antes do uso.

Precauções durante a preparação e uso

Se a solução de Tris mudar de cor com frequência, isso indica que pode haver problemas com o ambiente de preparação ou as condições de armazenamento. Verifique se a pureza da água usada para a distribuição atende aos requisitos, se o recipiente de armazenamento foi limpo completamente e se há resíduos metálicos. Alguns laboratórios estão acostumados a usar recipientes de vidro para preparar e armazenar soluções de Tris, que podem precipitar vestígios de metais após uso prolongado. Recomenda-se a troca para recipientes feitos de polipropileno ou polietileno de alta densidade. Para laboratórios que são sensíveis a íons metálicos, uma pequena quantidade de agente quelante, como EDTA, pode ser adicionada ao tampão Tris preparado para retardar a taxa de descoloração por oxidação dos íons metálicos na solução quelante. No entanto, deve-se notar que o próprio EDTA também pode afetar certos sistemas experimentais, e a compatibilidade precisa ser confirmada antes da adição.

(Pó de matéria-prima branca Tris)

Conclusão

O amarelamento da solução de Tris é um fenômeno comum, relacionado à reação de oxidação catalisada por íons metálicos. Uma solução com leve descoloração ainda pode ser usada normalmente na maioria dos experimentos rotineiros, mas recomenda-se descartá-la quando a cor escurecer significativamente ou ocorrer precipitação. Ao melhorar a qualidade da água usada para a preparação, usar recipientes e condições de armazenamento apropriados, a vida útil da solução de Tris pode ser efetivamente estendida.

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